第五章-基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达课件.pptx

1、第五章第五章 基因在大肠杆菌、酵基因在大肠杆菌、酵 母中的高效的表达母中的高效的表达第一节第一节 第二节第二节 基因在大肠杆菌中的高效表达基因在大肠杆菌中的高效表达第三节第三节 基因在酵母中的表达基因在酵母中的表达第一节基因的表达系统与表达策略第一节基因的表达系统与表达策略基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。加工过程。基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物白质产物即实现基因的高效表达。即实现基因的高效表达。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达

2、活动，基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。最佳的基因表达体系：最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高目的基因的表达产量高; ;表达产物稳定表达产物稳定; ;生物活性高生物活性高; ;表达产物容易分离纯化。表达产物容易分离纯化。宿主细胞的选择宿主细胞的选择 1 1、容易获得较高浓度的细胞、容易获得较高浓度的细胞 2 2、能利用易得廉价原料、能利用易得廉价原料 3 3、不致病、不产生内毒素、不致病、不产

3、生内毒素 4 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态 5 5、容易进行代谢调控、容易进行代谢调控 6 6、容易进行、容易进行DNADNA重组技术操作重组技术操作 7 7、产物的产量、产率高、产物的产量、产率高 8 8、产物容易提取纯化、产物容易提取纯化一一 适合目的基因表达的宿主细胞的要求适合目的基因表达的宿主细胞的要求二二 宿主细胞分为两大类宿主细胞分为两大类1 1 原核细胞：原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等链霉菌等2 2 真核细胞：真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物常用有酵母、丝状真菌

4、、哺乳动物 细胞等细胞等大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系表达体系对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表 达的调控机理已有了深刻了解。达的调控机理已有了深刻了解。有各类菌株和载体系列。有各类菌株和载体系列。目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样: :细细 胞内不溶性表达胞内不溶性表达( (包含体包含体) )、细胞内可溶性表达、细胞周质表、细胞内可溶性表达、细胞周质表 达等。达等。易培养，成本低。易培养，成本

5、低。优优 点点缺缺 点点 大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物， 提取困难提取困难因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体， 表达产物需经变性复性才恢复活性表达产物需经变性复性才恢复活性蛋白质不能糖基化。产物蛋白质蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N N端多余一个蛋氨酸残基端多余一个蛋氨酸残基其内毒素很难除去。其内毒素很难除去。酵酵 母母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁基因组小，

6、世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。真核基因成功表达。基因表达的基本过程基因表达的基本过程 基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。 首先，目的基因通过转录首先，目的基因通过转录(transcription)形成形成mRNA（信使（信使RNA, messenger RNA )； 然后，然后， tRNA （转运（转运RNA, transfer RNA）将）将各种氨基酸运送到核糖各种氨基酸运送到核糖体并按照体并按照mRNA的密码的密码子顺序

7、将各种氨基酸连子顺序将各种氨基酸连接成特定的氨基酸序列接成特定的氨基酸序列(translation) 最终得到基最终得到基因 的 表 达 产 物 （ 蛋 白因 的 表 达 产 物 （ 蛋 白质）。质）。Transcription(转录转录): making an RNA copy of a DNA sequence . RNA polymerase opens the part of the DNA to be transcribed. Only one strand of DNA (the template strand, antisense strand) is transcribed.

8、转录的具体过程转录的具体过程有效转录的基本条件有效转录的基本条件启动子（启动子（promoterpromoter）：在基因序列中，标志着转录起始的：在基因序列中，标志着转录起始的 可被可被RNARNA聚合酶识别的位点聚合酶识别的位点(DNA(DNA区区 段段) )，一般位于基因的上游。，一般位于基因的上游。终止子（终止子（terminatorterminator）：位于基因的编码序列之外（一般：位于基因的编码序列之外（一般 在下游）的一段标志着转录停止在下游）的一段标志着转录停止 的的RNARNA聚合酶识别位点。聚合酶识别位点。1 1 具备起始密码子具备起始密码子2 2 具备终止密码子具备终止

9、密码子3 3 具有正确的阅读框具有正确的阅读框正确翻译的基本条件正确翻译的基本条件根据表达蛋白用途选择基因的表达策略根据表达蛋白用途选择基因的表达策略一一 生物化学和分子生物学研究生物化学和分子生物学研究二二 表达蛋白质用作抗原表达蛋白质用作抗原三三 结构研究结构研究真核基因表达的特点真核基因表达的特点基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在一条成熟的一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式样的多基因操纵子模式 基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几

10、百个甚至上千基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因是通过改变基因5上游区上游区DNA的构型来影响的构型来影响RNA聚合酶与启动聚合酶与启动子区的结合子区的结合mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程通常都有复杂的成熟和剪接过程 原核体系中表达真核基因的困难原核体系中表达真核基因的困难1. 细菌的细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；聚合酶不识别真核基因的启动子；2.

11、 真核基因转录的真核基因转录的mRNA在原核细胞中不能结合在原核细胞中不能结合到核糖体上；到核糖体上；3. 真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；，也就不能表达出有功能的真核蛋白；4. 表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。被细菌蛋白酶降解破坏。将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和将真核基因克隆

12、到一个强大的原核启动子和SDSD序列的下游，序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。使得真核基因处于原核调控体系中。采用真核基因的采用真核基因的cDNAcDNA序列作为构建表达载体的目的基因，序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有这样就解决了原核细胞没有RNARNA剪接功能的问题。剪接功能的问题。构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽以避免被原核蛋白酶的识别和降解

13、，最后可以将融合多肽切除。切除。构建表达载体的策略构建表达载体的策略R3510SD编码序列编码序列OriTcrTT启动子启动子起始密码子起始密码子AUG、GUG、UUG终止密码子终止密码子UAAU、UGA、UAG大肠杆菌表达载体的成份大肠杆菌表达载体的成份 大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。肠杆菌中有效复制的复制子。第二节第二节 克隆基因在大肠杆菌中的表达克隆基因在大肠杆菌中的表达启动子启动子 要

14、求是：强启动子是诱导性的，如热诱导和化学诱导要求是：强启动子是诱导性的，如热诱导和化学诱导转录终止子转录终止子 使转录终止，增强使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水的稳定性，提高蛋白质产物的表达水平。尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。平。尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。核糖体结合位点核糖体结合位点 在转录起始位点下游的一段在转录起始位点下游的一段DNA序列（序列（SD，5AGGAGG3）(4)筛选标记基因筛选标记基因(5)密码子的选择密码子的选择大肠杆菌表达载体的成份大肠杆菌表达载体的成份常见的大肠杆菌表达系统常见的大肠杆菌表达系统T7表达系统：表达系统：

15、T7噬菌噬菌RNA聚合酶能选择性的激活聚合酶能选择性的激活T7噬菌体噬菌体启动子的转录，其启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌合成速率相当于大肠杆菌RNA聚聚合酶的合酶的5倍。倍。Lac表达系统：表达系统：是是-半乳糖苷酶编码基因半乳糖苷酶编码基因LacZ的转录的调的转录的调控序列，该启动子可以被控序列，该启动子可以被IPTG诱导，所以在培养基中加诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。TacTac表达系统：表达系统：是一种由是一种由Lac和和Trp启动子杂合而成的启动启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被

16、子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导表达。诱导表达。P PL L表达系统：表达系统：是负责是负责DNA分子转录的启动子之一，是一分子转录的启动子之一，是一种极强的启动子。种极强的启动子。影响克隆基因表达效率的因素影响克隆基因表达效率的因素一般而言，所用启动子的强度、一般而言，所用启动子的强度、DNADNA的转录起始序列、密码子的转录起始序列、密码子的选择、的选择、mRNAmRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。在一定程度上影响到转基因的表达。a. 启动子的结构对表达效率的影响启动子的结构对表达效率的影

17、响 大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区, ,即即-10-10区区( (位于位于转录其始位点上游转录其始位点上游5-10bp5-10bp，故称为，故称为-10-10区，序列为区，序列为5-5-TATAATATAAT T) )和和-35-35区区( (位于转录起始位点上游位于转录起始位点上游25bp25bp处，一般有处，一般有10bp10bp组成，组成， 5- TTGACA5- TTGACA故称为故称为-35-35区，区，) )。当然，实际。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启

18、动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于越是接近于17bp17bp，启动子的活性就越强。，启动子的活性就越强。-AGGAGGUXXXAUG- -AGGAGGUXXXAUG- mRNAAUUCCUCCACUAG-AUUCCUCCACUAG-16S rRNA3 末端末端b.b.翻译起始序列对表达效率的影响翻译起始序列对表达效率的影响mRNAm

19、RNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的mRNAmRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子序列中，核糖体的结合位点是起始密码子AUGAUG和其上游的和其上游的SDSD序列。所谓序列。所谓SDSD序列序列就是由就是由Shine-DalgarnoShine-Dalgarno首先提出的一种位首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。一般合和翻译起始所必需。一般SDSD序列的长度约为序列的长度约为3-9bp3-9bp，位于起始，位于起始密

20、码子上游密码子上游3-113-11碱基的位置，它与碱基的位置，它与16S16S核糖体核糖体RNARNA的的33端互补，端互补，控制了翻译的起始。控制了翻译的起始。PromoterSDAUGGeneTerminatorUAAmRNA研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这一因素的影响。另大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这一因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结

21、构，最终导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。影响的目的基因的表达效率。c.c.启动子与克隆基因间的距离对基因表达的启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响影响融合表达一般是将基因引入某表达载体编码的高表达融合表达一般是将基因引入某表达载体编码的高表达蛋白（担体蛋白）序列的蛋白（担体蛋白）序列的33末端。表达出来的融合蛋末端。表达出来的融合蛋白的白的N N末端含有由担体序列编码的片段。末端含有由担体序列编码的片段。融合蛋白可以直接用作抗体，但通常是将融合蛋白可以直接用作抗体，但通常是将N N端的单体端的单体蛋蛋白部分从白部分从C C端的目的蛋白中裂解出

22、来，有利于对目的蛋端的目的蛋白中裂解出来，有利于对目的蛋白进行生化研究及功能分析。方法主要有：化学裂解白进行生化研究及功能分析。方法主要有：化学裂解法和酶解法。法和酶解法。蛋白质的融合表达蛋白质的融合表达蛋白质的分泌型表达蛋白质的分泌型表达 将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游有可将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游有可能实现分泌表达能实现分泌表达实现蛋白质分泌表达有许多有利之处实现蛋白质分泌表达有许多有利之处1.1.在穿膜过程中信号肽被信号肽酶切除。生产的蛋白质和天然在穿膜过程中信号肽被信号肽酶切除。生产的蛋白质和天然 蛋白质是一致的。蛋白质是一致的。2.2.周质中蛋白酶活性

23、低，分泌的蛋白稳定。周质中蛋白酶活性低，分泌的蛋白稳定。3.3.周质中细菌的蛋白很少，使得重组蛋白易纯化。周质中细菌的蛋白很少，使得重组蛋白易纯化。4.4.周质中提供了一个氧化环境，更有利于二硫键的正确形成。周质中提供了一个氧化环境，更有利于二硫键的正确形成。对于许多难以纯化的蛋白质可以通过分泌表达来实现生产对于许多难以纯化的蛋白质可以通过分泌表达来实现生产蛋白质的包含体形式表达蛋白质的包含体形式表达重组蛋白在大肠杆菌中高表达时，绝大多数是以包含体重组蛋白在大肠杆菌中高表达时，绝大多数是以包含体形式存在的。形式存在的。包含体就是表达的蛋白质在细胞内聚集成没有生物活性包含体就是表达的蛋白质在细胞

24、内聚集成没有生物活性的固体颗粒。的固体颗粒。不可溶、无生物活性的包含体必需经过变性、复性才能不可溶、无生物活性的包含体必需经过变性、复性才能获得天然结构及生物活性。获得天然结构及生物活性。减少包含体形成的策略减少包含体形成的策略1.1.降低重组菌的生长温度降低重组菌的生长温度2.2.添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂。如添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂。如 高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖3.3.供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pHpH 值等值等 不过，包含体的形成有时也是有利的，不仅可以获得

25、不过，包含体的形成有时也是有利的，不仅可以获得高表达、高纯度的蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组高表达、高纯度的蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白的破坏。蛋白的破坏。有效、理想的复性方法应具备一下几个特点有效、理想的复性方法应具备一下几个特点 1.1.活性蛋白质的回收率高活性蛋白质的回收率高2.2.正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离3.3.折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品4.4.折叠复性方法利用放大折叠复性方法利用放大5.5.复性过程耗时较少。复性过程耗时较少。第三节第三节 基因在酵母中的高效表达基因在酵母中的高

26、效表达1.1.缺失真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工，如剪切、缺失真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等糖基化、形成二硫键等2.2.表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复杂的复表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和生物活性性才能恢复构象和生物活性 因此，可以使用真核生物酵母作为表达菌。如酿酒因此，可以使用真核生物酵母作为表达菌。如酿酒酵母、甲醇酵母等。酵母、甲醇酵母等。大肠杆菌表达系统的缺陷大肠杆菌表达系统的缺陷甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统甲醇酵母能利用甲醇为其唯一碳源甲醇酵母能利用甲醇为其唯一碳源甲醇代谢的第一步是甲醇在乙醇氧化酶作用下氧化

27、成甲醇代谢的第一步是甲醇在乙醇氧化酶作用下氧化成甲醛，乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱，因此甲醇酵母甲醛，乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱，因此甲醇酵母代偿性的大量产生这种酶代偿性的大量产生这种酶调控乙醇氧化酶的启动子是强启动子，可用来调控异调控乙醇氧化酶的启动子是强启动子，可用来调控异源蛋白的表达。源蛋白的表达。甲醇酵母表达系统的优点甲醇酵母表达系统的优点1.1.具有强启动子，可严格调控目的蛋白的表达具有强启动子，可严格调控目的蛋白的表达2.2.可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表 达出的蛋白具有生物活性达出的蛋白具有生物活性3.3.营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产4.4.可高密度发酵培养。可高密度发酵培养。影响目的基因在甲醇酵母中表达影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素的因素1.1.目的基因的特性目的基因的特性2.2.表达框的染色体整合位点与基因拷贝数表达框的染色体整合位点与基因拷贝数3.3.宿主的甲醇利用表型宿主的甲醇利用表型4.4.分泌信号分泌信号5.5.产物稳定性产物稳定性6.6.翻译后修饰翻译后修饰