对流免疫电泳课件.ppt

1、 对流对流免疫电泳是双向琼脂扩散与电泳技术的免疫电泳是双向琼脂扩散与电泳技术的结合。结合。Ag或或Ab分子在一定的分子在一定的pH溶液中带有电荷，溶液中带有电荷，在电场作用下可发生定向移动。将在电场作用下可发生定向移动。将Ag、Ab分别加分别加在在pH为为8.6缓冲液琼脂中电泳，因各种血清蛋白缓冲液琼脂中电泳，因各种血清蛋白质都带负电荷，泳向阳极。由于电渗作质都带负电荷，泳向阳极。由于电渗作用，液体用，液体则流向阴极，二者方向相反。则流向阴极，二者方向相反。 Ab带负电荷少，分子量大，所以电泳力小于电渗带负电荷少，分子量大，所以电泳力小于电渗力，向阴极移动。而力，向阴极移动。而Ag所带负电荷多

2、，分子量较所带负电荷多，分子量较小，故其电泳力大于电渗力，向正极移动。小，故其电泳力大于电渗力，向正极移动。 如如Ag、Ab相应，相遇，在比例适当时即形成相应，相遇，在比例适当时即形成白色沉淀线。由于电场限制了白色沉淀线。由于电场限制了AgAb分子的自由扩分子的自由扩散，因而提高了试验的敏感性散，因而提高了试验的敏感性(提高提高1020倍倍)，并，并缩短了反应时间（与双向琼脂扩散相比）。同双缩短了反应时间（与双向琼脂扩散相比）。同双扩，可定性确定抗原含量。扩，可定性确定抗原含量。 抗原：待测人血清抗原：待测人血清 抗体：抗人血清抗体：抗人血清 巴比妥缓冲液（巴比妥缓冲液（0.05 mol/L,

3、 Ph 8.6）、）、1.5%巴比妥巴比妥缓冲离子琼脂缓冲离子琼脂 其他：电泳仪、琼脂板打孔器、载玻片、毛细吸管、其他：电泳仪、琼脂板打孔器、载玻片、毛细吸管、电表电表 制板：取制板：取4 ml 煮沸的煮沸的1. 5 巴比妥琼脂，立即浇巴比妥琼脂，立即浇注在玻片上，制成厚薄均匀的琼脂板注在玻片上，制成厚薄均匀的琼脂板 打孔：待琼脂凝固后，用打孔器按下图打孔，孔打孔：待琼脂凝固后，用打孔器按下图打孔，孔径径3 mm，孔距，孔距5 mm。 加样：用微量加样器取加样：用微量加样器取Ag（人血清）（人血清）20 L分别分别加于阴极侧加于阴极侧1、2、3、4孔内，阳极侧孔内，阳极侧5、6、7、8各孔均加

4、抗体（抗人血清）。加样量以孔满为宜，各孔均加抗体（抗人血清）。加样量以孔满为宜，但不可溢出孔外。但不可溢出孔外。 电泳：琼脂板放入电泳槽内，琼脂板两端用滤纸电泳：琼脂板放入电泳槽内，琼脂板两端用滤纸或纱布与缓冲液相接，或纱布与缓冲液相接，Ag端接负极电源，端接负极电源，Ab端端接正极电源。接正极电源。按电场强度按电场强度46 V/cm电泳电泳50 min左左右。右。 电泳完毕，关闭电源，取出琼脂板，在黑色背景电泳完毕，关闭电源，取出琼脂板，在黑色背景下观察，凡下观察，凡AgAb孔间出现白色沉淀线者为阳性，孔间出现白色沉淀线者为阳性，孔间无白色沉淀线者为阴性。如沉淀线不清晰可孔间无白色沉淀线者为

5、阴性。如沉淀线不清晰可将琼脂板置将琼脂板置37温箱数小时后再进行观察，也可温箱数小时后再进行观察，也可染色观察。染色观察。 在在Ag与与Ab孔间出现沉淀线者为阳性。沉淀线形孔间出现沉淀线者为阳性。沉淀线形状、位置等差异，与状、位置等差异，与Ag、Ab浓度及分子量有关。浓度及分子量有关。相 关 知 识 抗原抗原-抗体反应包括凝集反应、沉淀反应、补抗体反应包括凝集反应、沉淀反应、补体结合反应和中和反应等。体结合反应和中和反应等。 抗原抗原-抗体反应可用抗体反应可用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。的抗原检测未知的抗体。 免疫荧

6、光技术、免疫酶技术、同位素标记免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体反应的敏感性。抗体反应的敏感性。 抗原抗原-抗体反应的特点抗体反应的特点:1. 特异性特异性：抗原：抗原-抗体的结合是特异性结合抗体的结合是特异性结合2. 可逆性可逆性：抗原抗体结合是分子表面的非共价键：抗原抗体结合是分子表面的非共价键 结合结合3. 阶段性阶段性：抗原抗体反应可分为两个阶段：抗原抗体反应可分为两个阶段 特异性结合阶段特异性结合阶段 可见的反应阶段可见的反应阶段4. 比例性比例性：抗原和抗体结合是否呈现可见的反应：抗原和抗体结

7、合是否呈现可见的反应 现象与两者的分子比例密切相关现象与两者的分子比例密切相关抗原抗原-抗体反应受多种因素影响抗体反应受多种因素影响1 . 电解质电解质：抗原：抗原-抗体反应通常应用抗体反应通常应用0.85%的氯化钠的氯化钠 作为稀释液作为稀释液 ，以供给适应浓度的电解质。，以供给适应浓度的电解质。2 . 温度温度：一般使用反应在：一般使用反应在37度水浴或孵育箱中进行。度水浴或孵育箱中进行。3. 酸碱度酸碱度：抗原：抗原-抗体反应适应的酸碱度为抗体反应适应的酸碱度为PH68。（一）凝集反应（一）凝集反应定义：是定义：是颗粒性颗粒性Ag（如完整的细菌、细（如完整的细菌、细 胞）与相应胞）与相应

8、 Ab，在适当条件下，出现肉眼可见的凝集物现象。，在适当条件下，出现肉眼可见的凝集物现象。方法：直接凝集（玻片凝集、试管凝集）方法：直接凝集（玻片凝集、试管凝集） 间接凝集间接凝集 1、直接凝集、直接凝集玻片凝集：定性实验，玻片凝集：定性实验，已知已知Ab测未知测未知Ag 用于细菌和血型鉴定用于细菌和血型鉴定 玻片凝集反应是在玻片上将抗体直接与玻片凝集反应是在玻片上将抗体直接与颗粒颗粒性抗原物质性抗原物质（如细菌、红细胞等）混合，在有适（如细菌、红细胞等）混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如性

9、结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。试管凝集试验：半定量实验试管凝集试验：半定量实验 已知已知Ag定量测定量测Ab 用已知的定量的用已知的定量的颗粒性颗粒性Ag悬液直接与系列悬液直接与系列稀释的待检血清（稀释的待检血清（Ab）在试管内混合，经一定）在试管内混合，经一定时间后，观察各管有无凝集，并根据凝集程度时间后，观察各管有无凝集，并根据凝集程度定量测定血清中的定量测定血清中的Ab水平及其效价。水平及其效价。 试管凝集试验试管凝集试验 管号管号 1 2 3 4 5 6 7 盐水盐水(mL) 0.5 0.5 0.5 0.

10、5 0.5 0.5 0.5 血清血清(mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃弃 0 抗原抗原(mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 终体积终体积(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 稀释度稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 盐水对照盐水对照 结果结果 + + + + + - - 效价效价 能与定量能与定量Ag产生明显凝集现象（产生明显凝集现象（+）的血清）的血清 最高稀释倍数最高稀释倍数 。2、间接凝集、间接凝集 将将可溶性可溶性Ag（或（或Ab）包被在惰性颗粒载体）包被在惰性颗粒载

11、体（红细胞、乳胶颗粒等）表面，再与相应（红细胞、乳胶颗粒等）表面，再与相应Ab（或（或Ag）反应，出现颗粒物凝集的现象。）反应，出现颗粒物凝集的现象。（二）沉淀反应（二）沉淀反应定义：可溶性定义：可溶性Ag（如血清蛋白、细胞裂解液或（如血清蛋白、细胞裂解液或 组织液等）与相应组织液等）与相应Ab特异性结合，在一定条件下，特异性结合，在一定条件下，出现肉眼可见的沉淀物现象。出现肉眼可见的沉淀物现象。方法：方法： 环状沉淀环状沉淀 絮状沉淀絮状沉淀 免疫比浊免疫比浊 琼脂凝胶扩散：琼脂凝胶扩散： 单向免疫扩散单向免疫扩散 双向免疫扩散双向免疫扩散 对流免疫电泳对流免疫电泳 火箭电泳火箭电泳 免疫电

12、泳免疫电泳单向免疫扩散单向免疫扩散原理原理 将某种特异性将某种特异性Ab混合于琼脂凝胶中，制成含混合于琼脂凝胶中，制成含Ab的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的的Ag加入孔中。加入孔中。 Ag在孔中向四周作辐射状扩散，如在孔中向四周作辐射状扩散，如Ag与已知与已知的的Ab相对应，在两者比例适合处出现由免疫复相对应，在两者比例适合处出现由免疫复合物所形成的白色沉淀环。合物所形成的白色沉淀环。 沉淀环直径的大小与沉淀环直径的大小与Ag的含量成正比。以不同的含量成正比。以不同浓度的标准浓度的标准Ag与固定浓度的与固定浓度的Ab抗体反应后测得抗体反应后测得沉淀

13、环的直径作为横坐标，以沉淀环的直径作为横坐标，以Ag浓度为纵坐标可浓度为纵坐标可绘制标准曲线。根据待测样本沉淀环的大小，从绘制标准曲线。根据待测样本沉淀环的大小，从标准曲线中即可推算其含量。主要用于定量测定标准曲线中即可推算其含量。主要用于定量测定抗原或抗原或IgG、 IgM、 IgA。3. Precipitation Reactions3. Precipitation ReactionsFIGURE6-5Diagrammaticrepresentationofradial&doubleimmunodiffusion.:precipitationreactionsingelsyieldvisi

14、bleprecipitinlines;novisibleprecipitateformsinregionsofAborAgexcess.in the Ab-containing semisolid mediumThe region of equivalence- The area is proportional to the conc. of Ag.双向免疫扩散双向免疫扩散原理原理 将可溶性将可溶性Ag和和Ab分别加到琼脂板上相应的小分别加到琼脂板上相应的小孔中，使两者各自向四周扩散，若孔中，使两者各自向四周扩散，若Ag与与Ab相对相对应，两者相遇即发生特异性结合，并在比例适合应，两者相遇即发

15、生特异性结合，并在比例适合处形成白色沉淀线。每一对应处形成白色沉淀线。每一对应Ag和和Ab可出现一可出现一条沉淀线，根据沉淀线的有无、位置、形状以及条沉淀线，根据沉淀线的有无、位置、形状以及对比关系，可分析对比关系，可分析Ag或或Ab成分。成分。3. Precipitation Reactions3. Precipitation ReactionsFIGURE6-5Diagrammaticrepresentationofradial&doubleimmunodiffusion.:precipitationreactionsingelsyieldvisibleprecipitinlines;no

16、visibleprecipitateformsinregionsofAborAgexcess.in the Ab-containing semisolid mediumThe region of equivalence- The area is proportional to the conc. of Ag. 双向扩散示双向扩散示火箭电泳火箭电泳原理原理 火箭电泳是单向免疫扩散和电泳相结合的一火箭电泳是单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测种定量检测Ag的技术。在含已知的技术。在含已知Ab琼脂中打孔，琼脂中打孔，再加入待测再加入待测Ag，通电后，通电后Ag定向地通过含有定向地通过含有Ab的的琼

17、脂，相应的琼脂，相应的Ag和和Ab在比例合适处形成沉淀峰。在比例合适处形成沉淀峰。沉淀峰的高度与沉淀峰的高度与Ag浓度呈正比。该法可定量检浓度呈正比。该法可定量检测测Ag。免疫电泳免疫电泳原理原理 免疫电泳是电泳和双向免疫扩散相结合的一免疫电泳是电泳和双向免疫扩散相结合的一种种Ag方法。先将待测方法。先将待测Ag加入琼脂板小孔中进行加入琼脂板小孔中进行电泳，因电泳速度不同可将待测电泳，因电泳速度不同可将待测Ag中的不同组分中的不同组分分开分开,然后再与横槽中已知然后再与横槽中已知Ab进行双向扩散，每进行双向扩散，每一对相应的一对相应的AgAb结合形成一条沉淀弧。根据弧结合形成一条沉淀弧。根据弧的数目、形状和位置，可分析样品中的的数目、形状和位置，可分析样品中的Ag原成分原成分及性质。及性质。