化学发光免疫(免疫学)PPT课件.ppt

1、612518赵祖国赵祖国 化学发光免疫技术化学发光免疫技术基于抗原抗体反应的免疫学检测技术基于抗原抗体反应的免疫学检测技术1.1.凝集反应凝集反应2.2.沉淀反应沉淀反应3.3.补体参与的反应补体参与的反应4.4.荧光免疫反应荧光免疫反应5.5.放射免疫放射免疫6.6.酶免疫技术酶免疫技术7.7.化学发光免疫技术化学发光免疫技术8.8.金免疫技术金免疫技术 化学发光免疫技术化学发光免疫技术第一节第一节 发光与化学发光剂发光与化学发光剂第二节第二节 发光酶免疫测定发光酶免疫测定（CLEIACLEIA）（chemiluminescence enzyme immunoasssaychemilumin

2、escence enzyme immunoasssay） 第三节第三节 化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA)（chemiluminescencechemiluminescence immunoassay immunoassay） 第四节第四节 电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(ECLI)(ECLI)(electrochemiluminescence(electrochemiluminescence immunoassay) immunoassay)化学发光免疫技术：化学发光免疫技术：集灵敏的化学发光分析和特异的抗原抗体免疫集灵敏的化学发光分析和特异的抗原

3、抗体免疫测定于一体的检测技术。测定于一体的检测技术。特点特点：特异性高、敏感性高、分离简便、特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。可自动化。概概 念念化学发光免疫技术的类型化学发光免疫技术的类型 按发光剂不同分为按发光剂不同分为 1.1.发光酶免疫测定发光酶免疫测定（C CLEIALEIA） chemiluminescence enzymeimmunoasssay 2. 2.化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA) chemiluminescence chemiluminescence immunoassay imm

4、unoassay 3. 3.电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(ECLI)(ECLI) electrochemiluminescence electrochemiluminescence immunoassay immunoassay 按分离方法不同分按分离方法不同分 1.1.微粒子化学发光免疫测定微粒子化学发光免疫测定 2.2.磁颗粒化学发光免疫测定磁颗粒化学发光免疫测定第一节第一节 发光与化学发光剂发光与化学发光剂一、发光一、发光 一种物质由一种物质由电子激发态电子激发态回复到基态时，回复到基态时， 释放出的能量表现为光的发射。释放出的能量表现为光的发射。1.1.光照发光光照发光

5、: :发光剂经短波长入射光照射后进入激发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。2.2.生物发光生物发光: :反应底物在荧光素酶的催化下利用反应底物在荧光素酶的催化下利用 ATPATP产能，生成产能，生成激发态的氧化荧光素激发态的氧化荧光素，后者在回，后者在回 复到基态时多余的能量以光子形式放出。复到基态时多余的能量以光子形式放出。3.3.化学发光化学发光: :在常温下由化学反应产生的光的发射。在常温下由化学反应产生的光的发射。 化学发光是一个多步骤的过程。化学发光是一个多步骤的过程。 荧光素酶荧光素酶ATPATP；O

6、 O2 2；MgMg2+2+氧化萤火虫荧光素氧化萤火虫荧光素 萤火虫荧光素萤火虫荧光素光光 + AMP+ O+ AMP+ O2 2 + CO+ CO2 2 + +化学发光化学发光 机制：机制：某些化合物可以利用化学反应产生的能某些化合物可以利用化学反应产生的能 量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子 激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基 态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。 化学发光剂或发光底物：化学发光剂或发光底物：在化学发光反应中参在化学发光反应中参 与能量

7、转移并最终以发射光子的形式释放能量与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量 的化合物。的化合物。 发光剂分为发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂荧光素、生物发光剂、化学发光剂 能参与化学发光反应；能参与化学发光反应； 与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂；与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂； 偶联后仍保留高的量子效应和反应动力；偶联后仍保留高的量子效应和反应动力； 应不改变或极少改变被标记物的理化特性，应不改变或极少改变被标记物的理化特性， 特别是免疫活性。特别是免疫活性。化学发光剂应符合以下几个条件化学发光剂应符合以下几个条件1.1.酶促反应的发光底物酶促反应的发光底物 是指经酶的

8、降解作用而发出光的一类发光底物。是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。 CLEIACLEIA中常用的酶有中常用的酶有HRPHRP和和ALPALP HRP HRP的发光底物有鲁米诺、对的发光底物有鲁米诺、对- -羟基苯乙酸羟基苯乙酸 ALPALP的发光底物有的发光底物有AMPPDAMPPD、4-MUP4-MUP（荧光底物）（荧光底物） 特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物 1.1 1.1 鲁米诺及其衍生物鲁米诺及其衍生物H H2 2O O2 2 /OH/OH- - HRPHRP+N+N2 2 + H+ H2 2O O + +光光对对- -羟基苯乙酸

9、（羟基苯乙酸（HPAHPA）HPAHPA在在H H2 2O O2 2存在下被存在下被HRPHRP氧化成氧化二聚体（荧光物氧化成氧化二聚体（荧光物质），在质），在350nm350nm激发光作用下，发出激发光作用下，发出450nm450nm波长的荧光，波长的荧光，可用荧光光度计测量。可用荧光光度计测量。 1.2 HPA 1.2 HPAH H2 2O O2 2HRPHRP+ +荧光荧光COOHHOCHCOOHHOCH22氧化二聚体氧化二聚体AMPPDAMPPD AMPPD AMPPD在碱性条件下，被在碱性条件下，被ALPALP解生成相当稳定的解生成相当稳定的 AMP-DAMP-D阴离子，其有阴离子，

10、其有2 230min30min的分解半衰期，发的分解半衰期，发 出波长为出波长为470nm470nm的持续性光，在的持续性光，在15min15min时其强度时其强度 达到高峰，达到高峰，151560min60min内光强度保持相对稳定。内光强度保持相对稳定。 光光ALPALP /OH/OH- - O OOCH3O- 1.3 AMPPD 1.3 AMPPD HPO42-4-MUP4-MUP被被ALP催化生成催化生成4-甲基伞形酮，在甲基伞形酮，在360nm的激发光的作用下，发出的激发光的作用下，发出448nm的荧光，可用荧的荧光，可用荧 光光度计进行测量。光光度计进行测量。荧荧光光ALP 1.4

11、 4-MUP4-MU360nm激发光激发光H3PO4 +2.直接化学发光剂直接化学发光剂特点：特点：不需催化剂，只需改变溶液的不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件等条件 就能发光的物质。反应迅速、背景低、就能发光的物质。反应迅速、背景低、 信比高，发光量与信比高，发光量与AE浓度呈线性关系。浓度呈线性关系。 常用试剂：常用试剂：吖啶酯（吖啶酯（acridinium，AE）+ CO2+ 光光NCH3COORHO+2-NCH3C OORONCH3C OOO3.3.电化学发光剂电化学发光剂 是指通过在电极表面进行电化学反应而发出是指通过在电极表面进行电化学反应而发出 光的物质。光的物质。特点：特点：

12、反应在电极进行；反应在电极进行； 电子供体为：三丙胺（电子供体为：三丙胺（TPATPA） 化学发光剂：三联化学发光剂：三联吡啶吡啶钌钌三联吡啶钌三联吡啶钌分子结构图分子结构图NNNNNNRuOONOORu（bpy3）2-电化学发光原理图电化学发光原理图 这一过程可在电极表面周而复始地进行这一过程可在电极表面周而复始地进行 产生许多光子，使光信号增强产生许多光子，使光信号增强 激发态激发态不稳定不稳定TPA+TPARu(bpy)3+Ru(bpy)Ru(bpy)2+光子(620nm)333*基态基态电极电极三、化学发光标记物的制备是将化学发光剂与抗原或抗体结合在一起的过程；利用发光剂与蛋白间的氨基

13、、羧基、硫氢基羟基等基团形成不可逆连接；例如：三联吡啶钌的羟基琥珀酰胺基团可与蛋白质、半抗原激素及核酸偶联。第二节第二节 发光酶免疫测定发光酶免疫测定（CLEIA）一、原理一、原理 属于酶免疫测定的一种。只是最后一属于酶免疫测定的一种。只是最后一 步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应 发出的光在特定的仪器上进行测定。发出的光在特定的仪器上进行测定。二、技术类型二、技术类型 根据酶促反应底物不同可分为：根据酶促反应底物不同可分为： 1.荧光酶免疫测定技术荧光酶免疫测定技术 2.化学发光酶免疫测定技术化学发光酶免疫测定技术 一）一） 反应模式：反应模式： 1

14、.双抗体夹心法：常用于大分子的检测双抗体夹心法：常用于大分子的检测 2. 双抗原夹心法：常用于抗原的检测双抗原夹心法：常用于抗原的检测 3.固相抗原竞争法：多肽类小分子的检测固相抗原竞争法：多肽类小分子的检测 二、技术要点二、技术要点 1.1.磁颗粒分离法：磁颗粒分离法：用抗原或抗体包被磁颗粒用抗原或抗体包被磁颗粒, ,与标与标 本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原结合本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原结合, , 最终通过磁场将结合酶标记物最终通过磁场将结合酶标记物ICIC和游离酶标记和游离酶标记 物进行分离的技术。物进行分离的技术。 二）二）B B、F F分离技术分离技术磁铁磁铁磁铁磁铁四

15、氧化三铁2.2.微粒子捕获法：微粒子捕获法：以无磁性微粒子作为抗体或抗原以无磁性微粒子作为抗体或抗原 的载体的载体, , 用纤维膜柱子分离酶标记物的结合状态用纤维膜柱子分离酶标记物的结合状态 和游离状态。和游离状态。3.3.包被珠分离法：包被珠分离法：用聚苯乙稀等材料制成的小珠作用聚苯乙稀等材料制成的小珠作 为抗原或抗体的载体为抗原或抗体的载体, ,经抗原抗体反应后经抗原抗体反应后, ,将将 结合状态和游离状态的酶标记物进行分离结合状态和游离状态的酶标记物进行分离. . 荧光酶免疫测定技术反应原理图荧光酶免疫测定技术反应原理图EEEEE 洗涤洗涤弃上清弃上清EE碱性磷酸酶 标记抗体E抗体包被塑

16、料微珠样本抗原 4MU激发荧光E 是利用理想的酶荧光底物，生成的产物稳定并有是利用理想的酶荧光底物，生成的产物稳定并有 强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量。强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量。化学发光酶免疫测定技术反应原理图化学发光酶免疫测定技术反应原理图EEEEE 洗涤洗涤弃上清弃上清EE碱性磷酸酶 标记抗体E抗体包被塑料微珠样本抗原AMPPDEAMPPD发光 是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，通过光强度的测定而直接进行定量。通过光强度的测定而直接进行定量。3.3.酶促发光反应酶促发光反应 加入加入4-MUP4-MUP，酶标抗体上，酶标抗体上

17、ALPALP将将4-MUP4-MUP分解成分解成4-MU4-MU，它在，它在360nm360nm激发光的照射下，激发光的照射下，发出发出448nm448nm的荧光，经电脑处理，记录光强度。的荧光，经电脑处理，记录光强度。三、方法学评价三、方法学评价1 1、灵敏度高、灵敏度高 经酶经酶+ +发光发光+ +发光增强剂发光增强剂+ +发光稳定剂发光稳定剂2 2、非特异性吸附可导致高本底；、非特异性吸附可导致高本底；3 3、洗涤不彻底可导致假阳性。、洗涤不彻底可导致假阳性。第三节第三节 化学发光免疫测定技术（化学发光免疫测定技术（CLIACLIA）一、原理一、原理 用化学发光剂直接标记抗原或抗体用化学

18、发光剂直接标记抗原或抗体, ,与与 待测标本中相应待测标本中相应AbAb或或AgAg、磁颗粒性的、磁颗粒性的AgAg或或AbAb反反 应，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离应，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离 状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入 发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的 检测进行定量或定性检测检测进行定量或定性检测 。二、技术类型二、技术类型 1.1.分离方法分离方法 常用磁颗粒分离技术常用磁颗粒分离技术 2.2.免疫学反应模式免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术同酶发光免疫测定技术 3

19、.3.不同只是相应标记物是吖啶酯而不是酶不同只是相应标记物是吖啶酯而不是酶 1.抗原抗体结合反应抗原抗体结合反应 McAb包被包被磁颗粒磁颗粒+待测标本待测标本+再加上再加上AE标记标记Ab 磁珠磁珠Ab-Ag-AE标记标记Ab复合物。复合物。 技术要点技术要点 2.分离技术分离技术 在磁场中进行在磁场中进行2-3次洗涤后，很快次洗涤后，很快 地将未结合的多余地将未结合的多余Ag和标记和标记Ab洗去。洗去。3.化学发光反应化学发光反应 充分洗涤后，加入充分洗涤后，加入H2O2和和pH纠正液纠正液NaOH，这时，这时AE不需要催化剂即分解并不需要催化剂即分解并发光，仪器检测并分析。发光，仪器检测

20、并分析。 1.AE1.AE其低背景噪音、化学反应简单、快速而无催其低背景噪音、化学反应简单、快速而无催 化剂。化剂。方法评价方法评价 2.AE2.AE与大分子的结合并无减少所产生的光量，与大分子的结合并无减少所产生的光量， 从而增加灵敏度，灵敏度可达从而增加灵敏度，灵敏度可达10-15g/ml10-15g/ml。3.AE3.AE标记试剂有效期长，可达一年。标记试剂有效期长，可达一年。4.4.固相分离剂为极细的磁粉，除增大包被面积，固相分离剂为极细的磁粉，除增大包被面积，加快反应外，亦同时使清洗及分离更简易、快捷。加快反应外，亦同时使清洗及分离更简易、快捷。第四节第四节 电化学发光免疫测定技术（

21、电化学发光免疫测定技术（ECLIECLI）一、原理一、原理 是一种在电极表面由电化学引发的特是一种在电极表面由电化学引发的特 异性异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化化学发光反应，实际上包括了电化学和化 学发光二个学发光二个过程。过程。ECLECL是电启动发光反应，而是电启动发光反应，而CL CL 是通过化合物混合是通过化合物混合启动发光反应。用化学发光启动发光反应。用化学发光 剂三联吡啶钌剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+标记标记AbAb，通过，通过Ag-AbAg-Ab 反应和磁珠分离技术，反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极根据三联吡啶钌在电极 上发出的光强度对待

22、测的上发出的光强度对待测的AgAg或或AbAb进行定量进行定量/ /定性。定性。二、技术类型二、技术类型 1.1.分离方法分离方法 常用磁颗粒分离技术常用磁颗粒分离技术 2.2.免疫学反应模式免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术同酶发光免疫测定技术 3.3.相应标记物是三联吡啶钌而不是酶相应标记物是三联吡啶钌而不是酶 1. 1.三联吡啶钌标记抗体三联吡啶钌标记抗体+ +生物素标记抗体生物素标记抗体+ +待测标本待测标本技术要点技术要点 2. 2.加入链霉亲和素（加入链霉亲和素（SASA）包被磁珠，使生物素（）包被磁珠，使生物素（B B）通）通过与亲和素（过与亲和素（A A）的结合，将磁珠、）的

23、结合，将磁珠、AbAb连接为一体，形连接为一体，形成双成双AbAb夹心法。夹心法。 3. 3.蠕动泵将蠕动泵将Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠磁珠复合体复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的电极表面。同时，游离的AbAb也被吸出测量室。也被吸出测量室。4.4.蠕动泵加入蠕动泵加入TPATPA，电极加电压，启动，电极加电压，启动ECLECL反应过程。反应过程。 该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，该过程在电极表面周而复始地进行，产生

24、许多光子， 光电倍增管检测光强度，其与光电倍增管检测光强度，其与Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+的浓度呈的浓度呈 线性关系线性关系, ,故可测出待测故可测出待测AgAg的含量。的含量。原理图原理图生物素标记生物素标记的抗体的抗体钌标记抗体钌标记抗体抗原抗原+SASA磁珠磁珠方法评价方法评价标记物的再循环利用，使发光时间更长、强标记物的再循环利用，使发光时间更长、强 度更高、易于测定；度更高、易于测定；敏感度高，可达敏感度高，可达pgpgmlml或或pmolpmol水平；水平；线性范围宽线性范围宽10104 4；反应时间短，反应时间短，20min20min以内可完成测定；以内可完成测定；试剂稳定性好，试剂稳定性好，2 255可保持一年以上。可保持一年以上。 五、临床应用五、临床应用1.1.甲状腺激素甲状腺激素 2.2.生殖激素生殖激素3.3.肾上腺肾上腺/ /垂体激素垂体激素 4.4.贫血因子贫血因子5.5.肿瘤标记物肿瘤标记物 6.6.感染性疾病感染性疾病7.7.糖尿病糖尿病 8.8.心血管系统心血管系统9.9.病毒标记物病毒标记物 10.10.骨代谢骨代谢11.11.过敏性疾病过敏性疾病 12.12.治疗药物监测治疗药物监测