直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体抗原课件.ppt
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1、第十四章第十四章 临床免疫检验自动化分析临床免疫检验自动化分析 免疫检验自动化免疫检验自动化 (automation of immunoassays) 是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制,自动化告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制,自动化进行。进行。 2020世纪世纪50-8050-80年代年代: :免疫学检测主要是免疫学检测主要是手工操作手工操作 2020世纪世纪8080年代末年代末: :随着单克隆抗体技
2、术、免疫标随着单克隆抗体技术、免疫标记技术以及计算机技术的出现,记技术以及计算机技术的出现,自动化免疫分析自动化免疫分析技术技术引入临床引入临床- 提高检测灵敏度,增加检测项目提高检测灵敏度,增加检测项目- 缩短检测时间缩短检测时间- 提高实验结果的精确度和准确度提高实验结果的精确度和准确度自动化免疫分析仪的共同特点自动化免疫分析仪的共同特点计算机系统计算机系统样本处理样本处理系统系统自动稀释自动稀释自动进样自动进样自动清洗自动清洗主机系统主机系统温育反应温育反应系统系统信号检测信号检测系统系统信号处理及信号处理及数字转换数字转换信号储存信号储存分析报告分析报告试剂试剂系统系统免疫自动化仪器分
3、析技术免疫自动化仪器分析技术第一节第一节 免疫浊度测定的自动化分析免疫浊度测定的自动化分析第二节第二节 发光免疫测定的自动化分析发光免疫测定的自动化分析第三节第三节 荧光免疫测定的自动化分析荧光免疫测定的自动化分析第四节第四节 酶联免疫测定的自动化分析酶联免疫测定的自动化分析第一节免疫浊度测定的自动化分析第一节免疫浊度测定的自动化分析 免疫浊度分析的基本原理是:抗原、抗体在特定的电解质溶免疫浊度分析的基本原理是:抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应,形成小分子免疫复合物(液中反应,形成小分子免疫复合物(19S19S19S),使反应),使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下,形成的免疫复液
4、出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下,形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加,反应液的浊度亦随之增大,即合物量随抗原量的增加而增加,反应液的浊度亦随之增大,即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。 自动化免疫浊度分析自动化免疫浊度分析一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液时,被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而时,被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而减弱,在一定范围内,减弱,在一定范围内,吸光度吸光度与免疫复合物量呈正与免疫复合物量呈正相关,而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和相关,而形成的免疫复合物量
5、与参与反应的抗原和抗体的量呈抗体的量呈正相关正相关。与已知浓度的抗原标准品比较,。与已知浓度的抗原标准品比较,可确定标本中抗原含量。可确定标本中抗原含量。一、免疫透射比浊法一、免疫透射比浊法(一)(一)原理:原理: 1. 1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。将待检标本和抗原参考品作适当稀释。(二)仪器工作过程(二)仪器工作过程 2. 2.将待测标本和标准抗原溶液(将待测标本和标准抗原溶液(5 5个浓度抗原标准个浓度抗原标准品)与适当过量的抗血清混合,在一定条件下,抗品)与适当过量的抗血清混合,在一定条件下,抗原抗体反应完成后,在原抗体反应完成后,在340nm340nm处测定各管吸光度。处测定
6、各管吸光度。 3.按按log-logit转换或转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线方程进行曲线拟合,制备剂量拟合,制备剂量-反应曲线,由计算机处理,计算反应曲线,由计算机处理,计算出抗原浓度。出抗原浓度。(三)方法评价(三)方法评价 优点优点: : 灵敏度高,稳定性好,操作简便,结果准确灵敏度高,稳定性好,操作简便,结果准确 不足不足: : 抗体用量较大;抗体用量较大; 溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大 透射比浊测定在抗原抗体反应的第二阶段,检透射比浊测定在抗原抗体反应的第二阶段,检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行,耗时较长。测需在抗原抗
7、体反应达到平衡后进行,耗时较长。 用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒(一般为(一般为0.2 m),),在在遇到相应抗原时,胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合,引起胶乳颗遇到相应抗原时,胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合,引起胶乳颗粒凝聚粒凝聚 ,使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示:,使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示:a a为单个为单个胶乳颗粒不阻碍光线透过,胶乳颗粒不阻碍光线透过,b b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒使透射光减弱或散射光增强。使透射光减弱或散射光增强。 二、免疫胶乳比浊法二、免疫胶乳比浊法
8、(一)(一)原理:原理:(二)方法评价(二)方法评价 本法敏感度大大高于普通比浊法,可达本法敏感度大大高于普通比浊法,可达ng/L水平,水平,操作简便,易自动化;血清中的类风湿因子操作简便,易自动化;血清中的类风湿因子(RF)可可与与IgG Fc段结合,使段结合,使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集,用性凝集,用F(ab)2片段代替片段代替IgG既可消除此干扰,既可消除此干扰,又可克服又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象;免疫胶乳轻度致敏胶乳的自凝现象;免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。自凝或抗体活性降低会严重影响结果。 粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光
9、粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光线照射后,微粒子对光线产生反射和折射而形成散线照射后,微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关,其公式如下:因素密切相关,其公式如下:三、免疫散射比浊法三、免疫散射比浊法原理原理 式式I 中为与入射光成中为与入射光成角处散射光强度;角处散射光强度;和和I0为入为入射光的波长和强度;射光的波长和强度;dn/dc为校正因子,反映了溶液为校正因子,反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变
10、化;折射指数和颗粒浓度的变化;M为颗粒分子量;为颗粒分子量;c为为浓度;浓度;N为阿佛加德指数;为阿佛加德指数;为颗粒到检测器的距离;为颗粒到检测器的距离;为散射光与入射光的夹角(散射夹角)。为散射光与入射光的夹角(散射夹角)。II042(dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24 两种散射:两种散射:Rayleigh-散射散射(颗粒直径(颗粒直径入射光波长入射光波长:不均匀散射)不均匀散射) 大多数蛋白质分子直径比光波长小很多,因而只产大多数蛋白质分子直径比光波长小很多,因而只产生生Rayleigh-散射散射 Rayleigh散射:散射光的强度与复合物的量呈正比、散射:散射光的强度与复合物
11、的量呈正比、与入射光波长成反比。与入射光波长成反比。散射颗粒与散射光散射颗粒与散射光 散射免疫比浊分析时一定要保持抗体过量,以维持散射免疫比浊分析时一定要保持抗体过量,以维持抗原抗体复合物的相对不溶解性;抗原抗体复合物的相对不溶解性; 测定的散射信号值应在曲线的上升臂部位测定的散射信号值应在曲线的上升臂部位,浊度信浊度信号与待测抗原量呈正比。号与待测抗原量呈正比。 定时散射比浊法定时散射比浊法 速率散射比浊法速率散射比浊法免疫散射比浊法免疫散射比浊法定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下,加入定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下,加入待测抗原,此时反应立即开始,在反应的第一阶段,待测抗原,此
12、时反应立即开始,在反应的第一阶段,溶液中产生的散射光信号波动较大,所获取的信号溶液中产生的散射光信号波动较大,所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段,即散射光信号是避开抗原抗体反应的不稳定阶段,即散射光信号在开始反应在开始反应7.5s2min内的第一次读数,专门在抗内的第一次读数,专门在抗原抗体反应的最佳时段进行读数,将检测误差降到原抗体反应的最佳时段进行读数,将检测误差降到最低。最低。 (一一)定时散射比浊法(定时散射比浊法(fixed time nephelometry)1. 1. 仪器测定技术要点
13、仪器测定技术要点 检测分两时间进行:检测分两时间进行: 预反应阶段预反应阶段-加少量样本与抗体反应,测定加少量样本与抗体反应,测定第一次散射光信号(第一次散射光信号(7.5-120s);); 反应阶段反应阶段-加入全量待测样本,加入全量待测样本,4分钟内测定分钟内测定第二次散射光信号。第二次散射光信号。 第二次散射光信号作为待测抗原与抗体形成复合物第二次散射光信号作为待测抗原与抗体形成复合物颗粒产生的信号峰值,经计算机软件处理转换为待颗粒产生的信号峰值,经计算机软件处理转换为待测抗原浓度。测抗原浓度。2. 2. 抗原过量检测抗原过量检测 (1) 抗体适当过量抗体适当过量 (2) 对抗原过量进行
14、阈值限定对抗原过量进行阈值限定 定时散射比浊法测定原理示意图定时散射比浊法测定原理示意图 速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法。连续测定各时间复合物形成的速率与其产生定法。连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起,形成动态的速率散射比的散射光信号联系在一起,形成动态的速率散射比浊法,每项检测仅浊法,每项检测仅12min即可完成。即可完成。 ( (二二) )速率散射比浊法速率散射比浊法(rate nephelometry) 速率速率-指抗原抗体结合反应过程中,每一单指抗原抗体结合反应过程中,每一单位时间内两者结合的速度。位时
15、间内两者结合的速度。抗原抗体复合物形成表抗原抗体复合物形成表累积时间(秒)复合物形成的量形成速率值58-1013515251220603525150903023080353007040360604541555504504555480306050020 基本原理:基本原理:抗原与相应抗体以一定比例混合后,抗原与相应抗体以一定比例混合后,随着反应时间的延长,免疫复合物的总量逐渐增随着反应时间的延长,免疫复合物的总量逐渐增加,而速率的变化由慢快慢,反应时间最快加,而速率的变化由慢快慢,反应时间最快的某一时刻称为速率峰。当反应液中的抗体量保的某一时刻称为速率峰。当反应液中的抗体量保持过剩时,速率峰的高
16、低与抗原含量成正比,仪持过剩时,速率峰的高低与抗原含量成正比,仪器自动通过标准曲线将速率峰值转化为所测抗原器自动通过标准曲线将速率峰值转化为所测抗原的终浓度。的终浓度。 速率散射比浊原理图速率散射比浊原理图仪器测定技术要点仪器测定技术要点 开启机器,进行定标开启机器,进行定标 反应阶段反应阶段 抗原过量检测抗原过量检测 图图20-6抗原抗体反应散射光峰值的动态变化抗原抗体反应散射光峰值的动态变化抗原过量检测抗原过量检测 ( (三三) )散射比浊方法评价散射比浊方法评价 散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法,本散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法,本法自动化程度高,具有快速、灵敏、准确、精密
17、法自动化程度高,具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法,保证了结果的等优点。采用抗原过量检测方法,保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵准确性。但仪器和试剂价格比较贵, 对抗体的质对抗体的质量要求很高。量要求很高。1.抗原抗体比例抗原抗体比例 2.抗体的质量抗体的质量 3.增浊剂的使用增浊剂的使用 (一)免疫比浊分析的影响因素免疫比浊分析的影响因素 免疫比浊分析的影响因素和临床应用免疫比浊分析的影响因素和临床应用 4.伪浊度伪浊度 5.入射光光源和波长入射光光源和波长 6.结果报告中的计量单位结果报告中的计量单位 7.标准曲线制备与质量控制标准曲线制备与质量控制 (二)临床
18、应用(二)临床应用 免疫比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白免疫比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、链、链、链、免疫球蛋白亚类;补体链、免疫球蛋白亚类;补体C3、C4;血;血浆蛋白如前白蛋白浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白抗胰蛋白酶酶(1-AT)、2-微球蛋白微球蛋白(2-MG)、转铁蛋白、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白、结合珠蛋白(HP)、,、,C-反应蛋白反应蛋白(CRP)、载脂蛋白、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白、脂蛋白(a)、类风湿、类风湿因子因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。、尿微量
19、蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。 第二节发光免疫测定的自动化分析第二节发光免疫测定的自动化分析三大经典标记技术三大经典标记技术放射免疫技放射免疫技术术酶免疫技术酶免疫技术发光免疫技术发光免疫技术1.样本盘样本盘2.试剂盘试剂盘3.温育反应系统温育反应系统4.固相载体清洗和分离系统固相载体清洗和分离系统5.信号产生和检测系统信号产生和检测系统6.计算机数据处理和控制系统计算机数据处理和控制系统自动化发光免疫分析系统的组成自动化发光免疫分析系统的组成 发光发光: :是指分子或原子中的电子吸收能量后,由是指分子或原子中的电子吸收能量后,由基态(较低能级)跃迁到激发态(较高能级),基态(较低能级)跃迁
20、到激发态(较高能级),然后再返回到基态,并释放光子的过程。然后再返回到基态,并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为根据形成激发态分子的能量来源不同可分为: :光照发光、生物发光、光照发光、生物发光、化学发光化学发光等。等。 基本概念基本概念化学发光化学发光: :化学能化学能光照发光光照发光( (荧光荧光):):光能光能激发能不同激发能不同: : 化学发光化学发光(chemiluminescence)是指伴随化学反是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质应过程所产生的光的发射现象。某些物质( (发光剂发光剂) )在化学反应时,吸收了反应过程中所产生的化学能,在化学反应
21、时,吸收了反应过程中所产生的化学能,使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态,当电子从激发态回复到基态时,以发迁到激发态,当电子从激发态回复到基态时,以发射光子的形式释放出能量,这一现象称为化学发光。射光子的形式释放出能量,这一现象称为化学发光。化学发光化学发光 在化学发光反应中参与能量转移并最终在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物,称为以发射光子的形式释放能量的化合物,称为化学发光剂或发光底物。化学发光剂或发光底物。 化学发光剂化学发光剂 直接化学发光剂直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不
22、需直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用,直接参与发光反应,它们在酶的催化作用,直接参与发光反应,它们在化学结构上有产生发光的特有基团,化学结构上有产生发光的特有基团,可直接可直接标记抗原或抗体。标记抗原或抗体。 1. 1. 吖啶酯吖啶酯 在碱性条件下被在碱性条件下被H H2 2O O2 2氧化氧化时时, ,发出波长为发出波长为470nm470nm的光,具有很高的发的光,具有很高的发光效率,其激发态产物光效率,其激发态产物N-N-甲基吖啶酮是甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。该发光反应体系的发光体。 N-甲基吖啶酮2 2三联吡啶钌三联吡啶钌 三联吡啶钌三联吡啶钌 RU(bpy)3
23、RU(bpy)32+2+是是电化学发光剂,它和电子供体三丙胺(电化学发光剂,它和电子供体三丙胺(TPATPA)在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。反应。 三联吡啶钌三联吡啶钌电化学发光剂反应原理电化学发光剂反应原理 酶促反应发光剂:酶促反应发光剂: 是利用标记酶的催化作用,使发光剂(底是利用标记酶的催化作用,使发光剂(底 物)发光,这一类需酶催化后发光的发光剂物)发光,这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。称为酶促反应发光剂。 1鲁米诺及其衍生物鲁米诺及其衍生物 2金刚烷衍生物(金刚烷衍生物(AMPPD)1 1鲁米诺鲁米诺鲁米诺发光
24、原理鲁米诺发光原理2AMPPD3-(23-(2- -螺旋金刚烷螺旋金刚烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3-4-(3“- -磷酰氧基磷酰氧基) )苯苯-1,2-1,2-二氧杂环丁烷二氧杂环丁烷 分类:- 直接偶联:通过偶联反应使标志物分子中反应基团直接连接到被标志物分子的反应基团上。- 间接偶联:用功能交联剂在标志物分子和被标志物之间插入一条链或一个基团,使两种物质通过“桥”连接成结合物。优点:增加反应活性,减弱空间位阻效应。发光剂的标记技术发光剂的标记技术被标志物保持自身的特性(抗体特性),又具有标志物特性(发光被标志物保持自身的特性(抗体特性),又具有标志物特性(发光/ /催化发光)催
25、化发光)1. 1. 碳二亚胺(碳二亚胺(EDCEDC)缩合法)缩合法 2. 2. 过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法 3 3重氮盐偶联法重氮盐偶联法 4. N-4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法羟基琥珀酰亚胺活化法 化学发光免疫分析的类型:化学发光免疫分析的类型:一:直接化学发光免疫分析一:直接化学发光免疫分析二:化学发光酶免疫分析二:化学发光酶免疫分析1.1.辣根过氧化物酶标记的化学发光辣根过氧化物酶标记的化学发光2.2.碱性磷酸酶标记的化学发光碱性磷酸酶标记的化学发光三、电化学发光免疫分析三、电化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析 用吖啶酯直接标记抗体用吖啶酯直接标记抗体
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