发光免疫分析技术的原理和特点课件.ppt
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1、发光免疫分析技术的 原理和特点生物发光和化学发光 生物发光和化学发光作为两个古老而又年轻的技术,近年来得到了很大的发展。尤其在生物医学领域得到了广泛应用,已成为现代生物技术的组成部分。发光免疫分析技术及荧光素酶报告基因的应用已形成了产业。近几年在某些关键技术如生物传感器、基因序列分析、活体细胞ATP测定等方面取得了突破,其应用的范围进一步扩大,涵盖了生物医学的各个领域。生物发光 所谓的生物发光,就是生物体内发光蛋白通过消耗能量物质而产生的发光现象。其特点为只消耗能量物质,不消耗发光物质 萤火虫发光系统的量子效率,即产生光子数与消耗能量物质(ATP)分子数之比接近百分之百,这是至今为止发光效率的
2、最高纪录。因为即使是目前最先进的节能灯,其发光效率仅为2030%左右。 生物发光和化学发光均属于冷光范畴,即发光不是由于发光体温度升高所至,发射波长也与其温度无关。 自从萤火虫发光系统被揭示以来,经过多年的努力,目前发现存在发光现象的生物细菌、真菌、昆虫、蠕虫、水母、乌贼、鱼类、虾类等共有700多个种类,涉及17个门,其中绝大多数生活在海洋、特别是深海,有报道说在海平面数百米以下的大部分物种多具有生物发光现象。这些发光生物大部分为自身表达发光蛋白,而某些鱼则利用共生菌发光。生物发光的波长几乎涵盖了所有的可见光区域。 发光对于动物的主要意义包括求偶、寻食、防御、进攻等。有人认为细菌发光可能也属于
3、一种自身保护机制,目的在于消耗细胞内过多的氧化性物质。近年来,发现许多种发光强度、波长和闪了频率的变化尤其特定的含义,说明生物发光也许是生物个体间相互交换信息的一种手段。 近年来,随着越来越多的发光蛋白被提纯,其编码基因序列被测定、表达。其发光底物被人工合成相关的基础研究和产品的商业化进程迅速,已经发现的发光蛋白及其结构、活性部位、催化机理已被人们所认识。化学发光 化学发光是由于化学反应,通常是氧化反应产生电子能级处于激发态的物质,后者通过跃迁释放能量产生光子,从而导致的发光现象,其特点为消耗发光剂,同时量子效率相对较低。 化学发光按化学反应类型可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。 其中酶
4、促化学分光包括辣根氧化物酶系统、碱性磷酸酶系统、黄嘌呤氧化酶系统等。其中,在碱性磷酸酶反应体系中,螺旋金刚烷环氧化物苯磷酸酯及其衍生物可作为发光剂,又可作为氧化剂,即它可通过自身内氧化,启动发光反应而无需氧化剂。 而非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁鲁米诺系统等。 如果按发光持续时间分类,可分为闪光和辉光。 闪光型发光时间在数秒内,如吖啶酯系统。其检测方式一般采用原位进样和时间积分法测量,即在检测器部位加装进样器,并保证加入发光剂和检测两个过程同步进行,同时以整个发光信号峰的面积为发光强度。 辉光型发光时间在数分钟至数十分钟以上,如辣根过氧化物酶鲁米诺系统、碱性磷酸酶AMPPD系
5、统、黄嘌呤氧化酶鲁米诺系统等。其信号检测无需原位进样,一般以速率法测量,即在发光信号相对稳定的区域任一点测量单位时间的发光强度。 事实上,许多物质既是生物发光底物,同时又是化学发光底物,甚至是化学发光增强剂,因此生物发光和化学发光在分子和量子机理方面存在许多相似性。 近年来在常见的化学发光底物特别是螺旋金刚烷环氧化物苯磷酸酯类和吖啶酯类的发光机理研究中发现,大多数化学发光底物及其中间产物中均存在1,2-二氧四环结构,而且该结构的存在似乎对于生物发光底物也具有非常重要的意义。同时对于其化学发光过程中的量子机制,也提出了所谓的“化学起始的电子交换发光”学说。 基于上述理论,人类模拟自然界生物发光底
6、物的某些结构,已经合成了多个高效化学发光底物,其发光波长几乎覆盖了所有的可见光区域,量子效率也达到了空前水平,可以说,生物发光是人类推动化学发光技术进步的智慧源泉。发光信号的检测 以往的光信号检测仪器大多采用光敏二极管、光敏电池、电荷耦合器,或者以光电流放大方式工作的常规光电倍增管作为检测器件。其原理为:通过光电转换器件激昂光信号转换为电压或电流信号,再加以放大。其主要特点为:结构简单、性能稳定、但灵敏度低、线性范围较窄。 随着现代量子物理学的发展,以及人们对光的微观特性认识的逐步深入,一种被称为单光子计数器的新型高敏感度光电检测器在近期问世,其灵敏度及线性范围均大大超过其它常规技术。 单光子
7、计数器核心部件是一个光电倍增管他是一个超高度真空的玻璃容器,称为光阴极。而在内部还装有多个以特殊方式排列的电极,称为打拿极或加速极,其后部另有一个电极称为阳极,上述各个电极之间均有直流高压。 当光子打到光阴极时,由于光电效应,其表面可以产生能量微弱的游离电子,称为光电子。该电子由于直流高压的作用离开光阴极再次打到第一打拿极上,由于其获得了直流高压提供的能量,因而在第一打拿级上又制造出了能量更大、能量更多的电子,就这样经过多个打拿极的反复放大 最后使阳极产生了一个能量远远高于最初光子的电脉冲信号。该信号经前置放大器放大,在经过比较器去除噪声信号,最后由分频器换算出光子脉冲数。通常以相对发光单位即
8、RLU为单位,一个RLU相当于10个光子。 由于单光子计数器具有的卓越性能,它已成为现代光学仪器中最重要的部分之一,也是今后临床检验仪器发展的方向之一。事实上,正是由于它的发明及应用,使现代免疫及基因分析技术才能从放射性同位素的束缚中解放出来,真正步入安全化、非同位素化的新时代。 上述装置之所以称为单光子计数器,是因为仅用于单光子事件的测量,即待测物的辐射跃迁仅存在一种可能性,换句话说,其检测的光子能极是一样的。通常化学发光、生物发光、荧光等均属于单光子事件因此一般都用单光子计数器测量,而以往在放射性免疫分析中常用的液体或固体闪烁计数仪均使用多光子计数仪,其原因为放射性同位素导致的液体或固体闪
9、烁为多光子事件,即辐射跃迁存在多种可能性。换句话说,其光子的能级是多样的,而且不同的同位素具有各自不同的多个能级和跃迁方式,因此其测量方式为多能级符合方式。所以在闪烁测定时,不同类型的放射性同位素要选择与之相应的通道。 上述装置之所以称之为单光子计数器,是因为它仅用于单光子事件的测量,即待测物的辐射跃迁仅存在一种可能性;换句话说,其检测的光子能级是一样的。通常化学发光、生物发光、荧光等均属单光子事件,因此一般都用单光子计数器测量。而以往在放射性免疫分析中常用的液体或固体闪烁计数仪均使用多光子计数器,其原因为放射性同位素导致的液体或固体闪烁为多光子事件,及辐射跃迁存在多种可能性。换句话说,其光子
10、的能级是多样的,而且不同的同位素具有各自不同的多个能级和跃迁方式,因此其测量方式为多能级符合方式,所以在闪烁测定时,不同类型的放射性同位素要选择与之相应的通道。 值得一提的是,对于一般的酶促化学发光,如以过氧化物酶和碱性磷酸酶为催化剂的发光,由于其发光时间较长,又有较持久的坪区(发光信号稳定期),因此一般采取速率法测定,即在坪区任意时间点测定发光信号强度。而以吖啶酯和鲁米诺及其衍生物直接标记为代表的非酶促化学发光,由于其发光时间极短,且无稳定的坪区,因此一般采取时间积分的方式,即描记整个发光周期内的完整信号峰;此时一定要在发光分析系统中加入一套原位进样泵,并与检测器协同配合,以保证发光信号峰的
11、完整描记,但其加工精度和控制技术要求很高发光检测技术的特点与优势 光生物学检测技术之所以在短短的十几年内的到了迅速的发展,原因在于其很多的显著优越性。例如: 彻底消除了放射性等有害物对操作者和环境的危害; 无半衰期限制; 使试剂的稳定性和有效期大大延长; 信号自行去除,容易实现连续动态重复测定; 适合利用复合标记系统进行多指标并行测定; 操作简便,反应速度快,容易实现自动化, 灵敏度和线性范围超过以往技术等等。非放射性 以往在生物分析的定量检测中使用最普遍的当属放射性同位素标记及检测技术,它存在诸多的不足包括:某些放射性同位素由于半衰期短不利于储存和运输;同时由于放射性物质的污染对工作人员的健
12、康及环境造成一定危害需要特殊的防护及废物处理设备。因此人们一直在寻找非同位素标记的检测方法。光生物学技术由于其完全抛弃了放射性同位素,因此不仅消除了对环境和操作者的危害,而且也使试剂的 稳定性和有效期大大延长。同时由于发光信号可以在短时间内自行消失,因此非常容易实现连续、动态、重复测定,这一点特别适合于生物医学研究、法医鉴定等领域中的多标记、多指标并行测定;如果加上波长、延迟时间以及反应底物的差别,其分辨率更高。另外,由于其操作更加简单,反应速度更快,因此容易实现自动化事实上,正是由于光生物学技术的出现,才使得免疫分析真正做上自动化的道路。高灵敏度 通常酶联免疫技术的分析灵敏度可达到10mol
13、/L,新型的微珠包被酶放大免疫技术的分析灵敏度可达到10mol/L;荧光免疫及采用沉降法的普通放免技术可达到10mol/L;固相放免技术可达到10mol/L。而发光免疫分析技术的分析灵敏度已经达到10mol/L。 如果以每次实验的加样量为50ul,按摩尔常数为6.0210 计算,此时样品中仅有几十个待测物分子。这个灵敏度已经接近了免疫检测技术的理论极限。在现有的实验模式下,试图检测更少的待测物分子是不现实的。因为更高的灵敏度,必须要求加入反应的样品中存在数量非常恒定的待测物分子,以保证其检测结果的稳定性;但由于分子运动的存在,这显然是一个很不确定的随机事件。因此即使存在这样的方法,其检测结果的
14、可靠性也是根本无法接受的。所以除目前尚未应用于临床诊断的单分子检测技术以外,任何宣传采用常规加样方式的免疫分析技术能够在分析灵敏度上超越这一极限的论调,显然是荒谬的;因为溶液中分子的随机运动会毫不留情的扼杀这样的图谋。 事实上,上述灵敏度只是各个检测技术所能达到的极限。在实际应用中,由于受抗体亲和力的限制以及干扰免疫反应的因素影响,免疫检测试剂的分析灵敏度往往无法达到上述指标。特别是对发光免疫分析技术来讲,提高其检测灵敏度的瓶颈在于抗体亲和力和干扰免疫反应的因素,而不是检测技术本身。 目前,发光免疫分析技术不仅已经能够完全满足临床检验对于灵敏度的要求,而且正是由于发光免疫技术的出现,使得许多临
15、床检验项目的检测灵敏度和线性范围大大提高,从而极大的拓宽了其临床应用价值和范围,甚至做出了具有划时代意义的贡献。宽线性范围 所谓线性范围是指能够较为准确的检测的待测物浓度范围。在免疫分析中,有人用相关系数不低于0.99的参比品浓度范围表示;但该方法受拟合方式的影响且实际测定和计算过程比较麻烦。目前很多人建议用功能灵敏度作为其下限,而以测定变异不超过20%的最高待测物浓度为上限,这样的定义比较符合临床的实际需求。 通常,酶联免疫技术,包括新型的微珠包被酶放大免疫技术,由于受比色测量的线性关系只在稀溶液中成立的限制,加上反应杯及浑浊样品的散射吸收作用其线性范围不超过两个数量级,即1-10所谓散射吸
16、收作用是浑浊样品中的微粒对光信号的多次随机反射和吸收。 放免技术的线性范围可达到四个数量级,即1-10;其瓶颈为检测器性能和放化灭活作用。所谓放化灭活作用,是指在放射性标记过强时,射线能量作用与抗原、抗体分子,通过影响其结构稳定性使其生物活性下降的现象。因此,放化灭活现象的存在往往限制了放免技术灵敏度和线性范围的提高。 荧光免疫的线性范围可达到四个数量级即大于110;其瓶颈为浓度淬灭和荧光漂白作用。所谓浓度淬灭是指在高浓度荧光素条件下,由于靠近光源的荧光素大量吸收激发光能量,使得远离光源的荧光素可吸收的能量减少,从而造成荧光效率下降。而荧光漂白是在过强激发光作用下,由于荧光素结构的变化,使其暂
17、时或永久失去发射荧光能力的现象。所以,上述两种现象的存在均造成了对荧光技术灵敏度和现行范围的限制 而发光免疫分析技术,其线性范围已经达到了六个数量级,其瓶颈为检测器性能。因此,如果采用最新的双量程自动转换单光子计数器,其线性范围还可以达到八个数量级。 事实上,上述线性范围只是各个检测技术所能达到的极限。在实际应用中,由于受抗体亲和力的限制以及干扰免疫反应的因素影响,免疫检测试剂的线性范围往往无法达到上述指标。例如:发光和荧光技术均会受到无辐射跃迁和散射吸收作用的影响。所谓无辐射跃迁是指处于激发状态的荧光或发光底物以不发射光子的方式回到基态的现象;其原因是能量通过产热被释放,或者将能量传递给了其
18、他分子。上述两种现象在高浓度杂质存在时尤其明显,尤其在使用微粒包被时,散射吸收就会变得十分显著。特别是由于前滞效应的存在,某些采用一步发的免疫检测试剂线性范围更窄。通常抗体亲和力越强其检测灵敏度越高,但由于其结合反应更容易达到饱和,因此线性范围也就越窄长有效期 发光技术完全抛弃了放射性同位素,因此彻底摆脱了半衰期的限制,使试剂的稳定性和有效期大大延长。同时由于在发光液、抗体及标记物储存放免采取了玻璃化及抗氧化稳定剂等相关配套技术使试剂盒的有效期和稳定性远远超过以往的任何产品,达到了空前水平,有些产品的实际有效期甚至可达到常温保存18月。低运行成本 光生物学技术完全抛弃了放射性同位素,因此不仅省
19、去了放射性实验室的基础建设投资和操作者的日常保健费用而且也降低了相关的储存、运输、防护及废物处理的成本。而按照国际通行标准上述费用相当于试剂盒本身价格的数倍所以采用发光免疫分析技术,可是整体运行成本大大降低适合于中小医院及基层边远地区应用。常见的商品化发光免疫技术及其分析比较 目前在应用上已经实现商品化的发光免疫分析产品,基本上可分为: 化学发光 时间分辨荧光也称时间延迟光致发光 电化学发光-也称场致发光一、化学发光 化学发光按化学反应类型可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两种类型 酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶系统和碱性磷酸酶系统。分别以过氧化物酶、鲁米诺、氧化剂、增强剂以及螺旋金刚烷环
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