最新免疫磁珠技术主题讲座课件.ppt
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1、目录目录1 1 免疫磁珠技术简介免疫磁珠技术简介1.1 免疫磁珠的结构与性质1.2 免疫磁珠技术2 2 免疫磁珠技术的应用免疫磁珠技术的应用2.1 IMB技术在食品有害微生物检测中的应用2.2 免疫磁珠与其它检测手段的联用2.3 免疫磁珠技术在其他领域的应用2.4 免疫磁珠技术的优缺点及发展方向1.1.免疫磁珠技术简介免疫磁珠技术简介1.1 1.1 免疫磁珠的结构与性质免疫磁珠的结构与性质1.1.1 1.1.1 免疫磁珠的结构免疫磁珠的结构 免疫磁珠(免疫磁珠(IMBIMB),), 也称免疫磁性微球,也称免疫磁性微球, 是一是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子,种均匀、具有超顺磁性及
2、保护性壳的球形小粒子,基本上由载体微球和免疫配基结合而成。其核心为基本上由载体微球和免疫配基结合而成。其核心为顺磁性粒子,核心外层包裹一层高分子料,顺磁性粒子,核心外层包裹一层高分子料, 最外层最外层是免疫配基。是免疫配基。 载体微球载体微球 载体微球载体微球功能基功能基高分子层高分子层磁性物质磁性物质金属小颗粒(金属小颗粒(Fe2O3、Fe3O4)如聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙如聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯脂、聚丙烯酸、酶类、多糖(淀粉、烯脂、聚丙烯酸、酶类、多糖(淀粉、纤维素、葡聚糖、果胶等)、球蛋白纤维素、葡聚糖、果胶等)、球蛋白和牛血清白蛋白等,和牛血清白蛋白等,如氨基如氨基(-
3、NH2)、羧基、羧基(-COOH)、羟基羟基(-OH),使其表现具有疏水,使其表现具有疏水-亲水、非极性亲水、非极性-极性、带正电荷极性、带正电荷-带带负电荷等不同的物理性质。负电荷等不同的物理性质。 免疫配基免疫配基 免疫配基通过生物高分子的功能基团结合到免疫配基通过生物高分子的功能基团结合到磁性载体微球上形成免疫磁珠。由于载体微磁性载体微球上形成免疫磁珠。由于载体微球制备材料和方法不同,其表现出的物理性球制备材料和方法不同,其表现出的物理性质也不同,质也不同, 从而可结合不同的免疫配基,从而可结合不同的免疫配基, 如抗原、抗体、凝集素、如抗原、抗体、凝集素、DNA 和和RNA 等。等。配基
4、必须具有生物专一性的特点,配基必须具有生物专一性的特点, 而且载体而且载体微球与配基结合要不影响或改变配基原有的微球与配基结合要不影响或改变配基原有的生物学特性,生物学特性, 保证磁珠的特殊识别功能。保证磁珠的特殊识别功能。1.1.2 1.1.2 免疫磁珠的性质免疫磁珠的性质由于免疫磁珠的大小和形状具有均一性,由于免疫磁珠的大小和形状具有均一性, 从而可使从而可使靶物质迅速和有效地结合到磁珠上,也可使生成的靶物质迅速和有效地结合到磁珠上,也可使生成的新复合物在磁场中具有相同的磁响应性,且行为一新复合物在磁场中具有相同的磁响应性,且行为一致致磁珠的球形结构可消除与不规则形状粒子有关的非磁珠的球形
5、结构可消除与不规则形状粒子有关的非特异性结合特异性结合顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性,并做定向顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性,并做定向移动,移动, 从磁场移出时磁性消除,从磁场移出时磁性消除, 磁珠分散,磁珠分散, 由此可由此可方便地进行分离和磁性导向方便地进行分离和磁性导向保护性壳可防止磁性内核漏出或被载液腐蚀;保护性壳可防止磁性内核漏出或被载液腐蚀; 免疫配基可特异性地结合反应体系中相应的抗原、免疫配基可特异性地结合反应体系中相应的抗原、抗体、核酸等生物活性物质。抗体、核酸等生物活性物质。1.2 1.2 免疫磁珠技术免疫磁珠技术免疫磁珠免疫磁珠( immunomagnetic be
6、ad, IMB)( immunomagnetic bead, IMB)技术:技术:是一种以特异的抗原抗体反应为基础的免疫学检测和分离技术。它是以抗体包被的磁珠为载体,通过抗体与反应介质中特异性抗原结合,形成抗原抗体复合物,此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动,从而达到分离抗原的目的。基本原理:基本原理:磁性微球经过一定处理后,可将抗体结合到磁珠上,形成免疫磁性微球,免疫磁性微球的抗体与特异性抗原结合形成抗原微球复合物,该复合物在磁场中具有与其它组分不同的磁响应性,在磁力作用下,该复合物发生力学移动,从而达到分离抗原的目的。2.1 2.1 食品有害微生物检测中的应用食品有害微生物检测中的应用免
7、疫磁珠技术与常规检验方法相比具有显著的免疫磁珠技术与常规检验方法相比具有显著的优点,它能从样品中优点,它能从样品中迅速、有选择性地分离出迅速、有选择性地分离出目的微生物,有效地减少了背景的干扰,提高目的微生物,有效地减少了背景的干扰,提高了精准性。了精准性。还能还能捕获受损伤的靶细菌捕获受损伤的靶细菌,而目前所用的几种而目前所用的几种常规方法则不具备这样的能力。目前,免疫磁常规方法则不具备这样的能力。目前,免疫磁珠技术已经广泛应用于食品样品中致病微生物珠技术已经广泛应用于食品样品中致病微生物的检测。的检测。2 .2 .免疫磁珠技术的应用免疫磁珠技术的应用2.1.1 2.1.1 大肠杆菌大肠杆菌
8、O157O157的检测的检测 传统分离传统分离E.coli O157 H7所采用的直接分离所采用的直接分离法存在着鉴别力差、抑制杂菌能力弱、耗时长、法存在着鉴别力差、抑制杂菌能力弱、耗时长、工作量大等缺点。工作量大等缺点。采用免疫磁珠技术,能够快速地从各种食品样采用免疫磁珠技术,能够快速地从各种食品样品中分离富集品中分离富集E.coli O157 H7,满足流行病学,满足流行病学的研究要求和提高控制力度。的研究要求和提高控制力度。 现在这种免疫磁珠现在这种免疫磁珠的方法已经被英国公共健的方法已经被英国公共健康服务实验室认定为标准的分离方法,我国也康服务实验室认定为标准的分离方法,我国也已将免疫
9、磁珠法已将免疫磁珠法对大肠杆菌对大肠杆菌O157的检测纳入的检测纳入国家标准(国家标准(GB/T 4789.36-2008)和)和出入境检出入境检验检疫行业标准验检疫行业标准(SN/T 1059.5-2006)。 检样检样25g(mL)+225mL改良改良EC肉汤(肉汤(mEC+n),均质),均质225mL 免疫磁珠捕获免疫磁珠捕获涂布涂布CT-SMAC平板和改良平板和改良CHROMagar O157弧菌显色琼脂平板弧菌显色琼脂平板挑取可疑菌落挑取可疑菌落5个个10个,氧化酶阴性,革兰氏阴性杆菌接种个,氧化酶阴性,革兰氏阴性杆菌接种TSI MUG-LST 阳性阳性GB/T 4789.36-20
10、08 GB/T 4789.36-2008 免疫磁珠捕获法检测程序免疫磁珠捕获法检测程序 阴性阴性 血清学试验血清学试验 非非O157细菌细菌 生化试验生化试验 报告报告36 1oC18h24h36 1oC36 1oC18h24h18h24h增菌增菌免疫磁珠捕获与分离免疫磁珠捕获与分离 1.1.将将EppendorffEppendorff管按样品和质控菌株进行编号,每管按样品和质控菌株进行编号,每个样品使用个样品使用1 1支支EppendorffEppendorff管,然后插人到磁板架上管,然后插人到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡。在漩涡混合器上轻轻振荡E. coli O157E. coli
11、O157免疫磁珠溶免疫磁珠溶液后,用开盖器打开每支液后,用开盖器打开每支EppendorffEppendorff管的盖子,每管的盖子,每管加人管加人20 L E. coli 015720 L E. coli 0157免疫磁珠悬液。免疫磁珠悬液。 2.2.取取mEC+nmEC+n肉汤增菌培养物肉汤增菌培养物1 mL1 mL,加人到,加人到EppendorffEppendorff管中,盖上盖子,然后轻微振荡管中,盖上盖子,然后轻微振荡10 s10 s。每个样品更换每个样品更换1 1支加样吸头,质控菌株必须与样品分支加样吸头,质控菌株必须与样品分开进行,避免交叉污染开进行,避免交叉污染。 具体操作步
12、骤具体操作步骤 3. 3.结合结合: :在在18183030环境中,将上述环境中,将上述EppendorffEppendorff管管连同磁板架放在连同磁板架放在Dynal MXlDynal MXl样品混合器上转动或用样品混合器上转动或用手轻微转手轻微转10 min10 min,使,使E. coli O157E. coli O157与免疫磁珠充分接与免疫磁珠充分接触。触。 4. 4.捕获捕获: :将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。在将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。在3 min3 min内内不断地倾斜磁板架,确保悬液中与盖子上的免疫磁不断地倾斜磁板架,确保悬液中与盖子上的免疫磁珠全部被收集起来,此时,在
13、珠全部被收集起来,此时,在EppendorffEppendorff管壁中间管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。 5.5.吸取上清液吸取上清液: :取取1 1支无菌加长吸管,从免疫磁珠聚集支无菌加长吸管,从免疫磁珠聚集物对侧深人液面,轻轻吸走上清液。当吸到液面通物对侧深人液面,轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时,应放慢速度,以确保免疫磁过免疫磁珠聚集物时,应放慢速度,以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠,则应将珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠,则应将其放回到其放回到EppendorffEppendorff管中,并重复管中,并重复4步
14、骤。每个样品步骤。每个样品换用换用1 1支无菌加长吸管。支无菌加长吸管。 6. 6.洗涤洗涤: :洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤 4 6 4 6 。 7. 7.重复上述步骤重复上述步骤4 5 4 5 。 8. 8.免疫磁珠悬浮免疫磁珠悬浮: :将免疫磁珠重新悬浮在将免疫磁珠重新悬浮在100 L 100 L PBS-Tween 20PBS-Tween 20洗液中。洗液中。 9.9.涂布平板涂布平板: :用漩涡混合器将免疫磁珠混匀,用加样用漩涡混合器将免疫磁珠混匀,用加样器各取器各取50 L50 L免疫磁珠悬液分别转移至免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMACCT-S
15、MAC平平板和改良板和改良CHROMagar O157CHROMagar O157弧菌显色琼脂平板一侧弧菌显色琼脂平板一侧,然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半,然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半,再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后,翻转平板,于分完全吸收后,翻转平板,于3636士士1 01 0培养培养18 h-18 h-24 h -24 h 。菌落识别菌落识别 在在CT-SMACCT-SMAC平板上,典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光平板上,典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落,中心呈现较暗的灰褐色滑、较
16、小的无色菌落,中心呈现较暗的灰褐色; ;发酵山梨醇的菌发酵山梨醇的菌落为红色落为红色; ;在改在改CHROMagarO157CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板上为圆形弧菌显色琼脂平板上为圆形、较小的菌落,中心呈淡紫色一紫红色,边缘无色或浅灰色。、较小的菌落,中心呈淡紫色一紫红色,边缘无色或浅灰色。初步生化试验初步生化试验: : 在在CT-SMACCT-SMAC和改良和改良CHROMagarO157CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板弧菌显色琼脂平板上挑取上挑取5 5个个1010个典型或可疑菌落,分别接种个典型或可疑菌落,分别接种TSITSI琼脂,同时接琼脂,同时接种种MUG-LS
17、TMUG-LST肉汤,于肉汤,于3636士士1 1培养培养18h24h18h24h。必要时进行。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在氧化酶试验和革兰氏染色。在TSITSI琼脂中,典型菌株为斜面与琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈阳性反应呈黄色,产气或不产气,不产生硫化氢底层均呈阳性反应呈黄色,产气或不产气,不产生硫化氢(H2S)(H2S)。置。置MUG-LSTMUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察,无荧光产肉汤管于长波紫外灯下观察,无荧光产生者为阳性结果,有荧光产生者为阴性结果生者为阳性结果,有荧光产生者为阴性结果; ;对分解乳糖且无荧对分解乳糖且无荧光的菌株,在营养琼脂平板上分纯,于光的菌株,
18、在营养琼脂平板上分纯,于3636士士1 1培养培养18h24h18h24h,并进行鉴定。,并进行鉴定。大肠杆菌大肠杆菌O157O157的检测的检测FratamicoFratamico等将兔抗等将兔抗E.coli O157 H7多克隆抗体多克隆抗体连接到羊抗兔连接到羊抗兔IgGIgG包被的磁珠上,从食物增菌培包被的磁珠上,从食物增菌培养液中分离养液中分离O157H7O157H7菌株,再将带菌的磁珠接种菌株,再将带菌的磁珠接种到培养基上,加入荧光素标记的到培养基上,加入荧光素标记的O157H7O157H7抗血清,抗血清,在荧光显微镜下观察,此法敏感性为在荧光显微镜下观察,此法敏感性为10cfu/m
19、L10cfu/mL增增菌培养液。菌培养液。DecoryDecory等建立了免疫磁珠等建立了免疫磁珠- -免疫脂质体(免疫脂质体(IMB/ILIMB/IL)荧光试验方法,可在荧光试验方法,可在8h8h内快速检测出多种液态样内快速检测出多种液态样品(水样、苹果汁、苹果酒)中低至品(水样、苹果汁、苹果酒)中低至1cfu/mL1cfu/mL的的E. coli O157 H7,而传统微生物学方法不能从阴性而传统微生物学方法不能从阴性样本中区分出样本中区分出E. coli O157 H7感染样本。感染样本。 2.1.2 2.1.2 单核细胞增生李斯特菌的检测单核细胞增生李斯特菌的检测 传统的单增李斯特菌检
20、测方法检测周期长,传统的单增李斯特菌检测方法检测周期长,约约5 514d14d,步骤繁琐且灵敏度低,而,步骤繁琐且灵敏度低,而IMBIMB技术技术的优点在于在较低的菌液浓度时也可以通过的优点在于在较低的菌液浓度时也可以通过免疫磁珠的富集作用进行检测,缩短了检测免疫磁珠的富集作用进行检测,缩短了检测时间并进一步降低了单增李斯特菌的检测限。时间并进一步降低了单增李斯特菌的检测限。 2008年,我国将免疫磁珠检测单核细胞增年,我国将免疫磁珠检测单核细胞增生李斯特菌的方法纳入了出入境检验检疫行生李斯特菌的方法纳入了出入境检验检疫行业标准中业标准中(SN/T 0184.3-2008)。 检样检样25g(
21、mL)对对225mLFB1増菌液(増菌液(3030 士士1 ,24h24h士士1h1h) 1mL转种转种10mL FB2増菌液(増菌液( 35 35 ,24h24h士士1h1h)通过免疫磁珠捕获李斯特菌,然后再用灭菌缓冲液洗涤通过免疫磁珠捕获李斯特菌,然后再用灭菌缓冲液洗涤用用0.1mL的灭菌缓冲液重新制成悬液的灭菌缓冲液重新制成悬液吸取吸取50uL免疫磁珠悬液划线于免疫磁珠悬液划线于CHROMagar 显色培养基,显色培养基,OXA/PALCAM琼脂平板(琼脂平板(35 +1 ,24h28h) 各挑选各挑选5个典型菌落个典型菌落接种于接种于TSA-YE琼脂平板,纯培养琼脂平板,纯培养 鉴定和
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