基因表达系统大肠杆菌表达系统课件.ppt

1、1酵母表达系统酵母表达系统优点优点1 属于真核生物属于真核生物,可进行翻译后修饰可进行翻译后修饰,如糖基化如糖基化2 操作容易操作容易3 经济经济4 快速快速2酵母细胞结构酵母细胞结构3两种酵母表达系统两种酵母表达系统酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统Saccharomyces cerevisiae过去常用过去常用毕赤酵母毕赤酵母Pichia pastoris现在多用现在多用4Pichia pastoris 表达系统表达系统 Pichia pastoris 是甲醇利用型酵母是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯可以用甲醇作为唯一的碳源一的碳源. 易操作易操作,培养容易培养容易 表达量高表达量高, 可

2、达培养液中可达培养液中10 g/L 可以有真核生物的翻译后修饰可以有真核生物的翻译后修饰, 如糖基化如糖基化 避免了酿酒酵母的过糖基化问题避免了酿酒酵母的过糖基化问题561. Pichia pastoris 的表达载体的表达载体胞内表达载体胞内表达载体胞外表达载体胞外表达载体P. pastoris没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体 7Alcohol oxidase ,醇氧化酶醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛将甲醇氧化成甲醛 通过高表达来补偿酶活性不足通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子因此有强启动子

3、AOX1是主要的酶是主要的酶受甲醇严格控制受甲醇严格控制启动子用来驱动外源基因表达启动子用来驱动外源基因表达AOX2利用甲醇的能力低利用甲醇的能力低生长慢生长慢8宿主宿主His4突变，不能合成组氨酸，突变，不能合成组氨酸， 在在His缺陷培养基上不能生长；缺陷培养基上不能生长；质粒上有质粒上有His4, 可合成组氨酸，可合成组氨酸， 用用His缺陷平板筛选转化菌株。缺陷平板筛选转化菌株。histidinol dehydrogenase gene (his4)92. CONSTRUCTION OF THE VECTOR10胞内表达载体胞内表达载体, pAO815 11胞外表达载体胞外表达载体,

4、pIC9K, pIC9K12pPIC9k, 胞外表达载体胞外表达载体133. 多拷贝产生，多拷贝产生，pIC9K, 体内形成多拷贝体内形成多拷贝因为未线性化的环状质粒之间发生同源 重组的几率非常低 未线性化的环状质粒发生同源 重组的几率非常低14pAO815 可体外构建多拷贝15BamH I：GGATCC CCTAGGBgl II：AGATCT TCTAGA164. 宿主细胞宿主细胞 Pichia Strain 基因基因型型GS115AOX1正常，正常，Mul+ KM71AOX1被破坏，被破坏， MulS宿主的宿主的histidinol dehydrogenase gene (his4) 突变

5、突变可以在完全培养基可以在完全培养基YPD和含组氨酸的基础培养基上生长和含组氨酸的基础培养基上生长在表达质粒转入后才能在组氨酸缺陷培养基上生长在表达质粒转入后才能在组氨酸缺陷培养基上生长本身的回复突变为本身的回复突变为1/108。17 转化后细胞的甲醇利用能力转化后细胞的甲醇利用能力GS115 KM71AOX1正常，正常，Mul+AOX1被破坏，被破坏， MulS转化后对甲醇的利用转化后对甲醇的利用KM71无论在那里无论在那里交换，只能是甲交换，只能是甲醇低利用，因为醇低利用，因为宿主没有宿主没有AOX1甲醇高利用Sal I 、 Stu I切切甲醇低利用Bgl II切切GS115取决于质粒在宿

6、主细胞基因组上取决于质粒在宿主细胞基因组上交换的位置是否破坏宿主的交换的位置是否破坏宿主的AOX118线性化位点线性化位点质粒线性化后转化宿主细胞质粒线性化后转化宿主细胞线性化质粒发生同源 重组的几率提高 19pAO815和和pPIC9K在在Sal I 、Stu I 单切单切, 在在his 4插入插入（单交换），（单交换），不破坏宿主的不破坏宿主的AOX1，转，转化化GS115后产生：后产生： His +/Mut+单交换单交换同源重组基因转移法同源重组基因转移法 ：是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换原有基因片段。

7、20pAO815和和pPIC9K 在在Bgl II双切：双切： 在在5AOX1位点和位点和3AOX1双交换双交换，替，替换掉了宿主的换掉了宿主的AOX1基因，基因， 转化后转化后GS115产生产生 His +/Muts Bgl IIHis45 AOX13AOX1geneHis4AOX12122技术路线技术路线选择合适的内切酶位点选择合适的内切酶位点将基因插入载体将基因插入载体注注:pAO815和和pIC9K是穿梭载是穿梭载体体, 可在大肠杆菌中可在大肠杆菌中操作操作pAO815体外构建多拷贝体外构建多拷贝转化宿主细胞转化宿主细胞线性化质粒线性化质粒组氨酸缺陷平板组氨酸缺陷平板筛选重组子筛选重组

8、子23G418筛选筛选pIC9K 多拷贝多拷贝 PCR检测检测转化细胞中的基因插入转化细胞中的基因插入诱导表达诱导表达SDS-PAGE检测检测pAO815和和pPIC9K24酵母菌转化酵母菌转化PEG 1000 Transformation Method for PichiaBuffer A: 1.0 M Sorbitol (山梨醇山梨醇), 10 mM Bicine（N-二羟乙基甘氨酸 ）, pH 8.35 (Sigma), 3% (v/v) ethylene glycol (乙二醇 )Buffer B: 40% (w/v) Polyethylene glycol 1000 (Sigma),

9、 0.2 M Bicine, pH 8.35Buffer C: 0.15 M NaCl, 10 mM Bicine, pH 8.35Filter sterilize and store at -20C.25制备感受态细胞制备感受态细胞1. 划线接种酵母菌，划线接种酵母菌，YPD平板，平板， 30C for two days.2. 挑菌落于挑菌落于 10 ml YPD 30C 摇过夜摇过夜.3. 转培养到转培养到 100 ml YPD，starting OD600 of 0.1 and grow at 30C to an OD600 of 0.5 to 0.8.4. 3000 x g 收集细胞，

10、收集细胞， 用用50 ml of Buffer A洗细胞，室洗细胞，室温温.5. 细胞悬浮在细胞悬浮在 4 ml of Buffer A 中，分装成中，分装成0.2 ml于灭菌于灭菌的管中，的管中， 每管加每管加 11 l DMSO（-70度）度） ，混匀，液，混匀，液氮快速冷冻，氮快速冷冻， -70C保存。保存。26保持感受态细胞在冰冻状态作转化！保持感受态细胞在冰冻状态作转化！ Cell competence decreases very rapidly after the cells thaw even when held on ice. It is critical to add DN

11、A to frozen cell samples. To perform multiple transformations, it is recommended to process them in groups of six at a time.27Transformation 1. 10-50 g DNA（20 l液体中），液体中）， 直接加到直接加到 still-frozen tube of competent cells（40 g of denatured and sonicated salmon sperm DNA）；）； 2. 37C 水浴水浴5分钟，分钟， 中间混匀两次；中间混匀

12、两次；3. 加加 1.5 ml of Buffer B ， 彻底混匀；彻底混匀；4. 30C水浴水浴1 hour；5. 2000 x g 离心离心10 ， RT， 去上清，细胞悬浮在去上清，细胞悬浮在 1.5 ml Buffer C中；中；6. 离心后将细胞悬浮在离心后将细胞悬浮在 0.2 ml Buffer C中；中；7. 将细胞涂布在将细胞涂布在选择培养平板（选择培养平板（MD）上，上， 30C for 3 to 4 days.28储存液储存液10X YNB (13.4% Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate without amino aci

13、ds) ，抽滤；，抽滤；500X B (0.02% Biotin) ，抽滤；，抽滤；10X D (20% Dextrose葡萄糖 )，抽滤；，抽滤；10X M (5% Methanol)， 抽滤；抽滤；10X GY (10% Glycerol)，高压；，高压；1 M potassium phosphate buffer, pH 6.0， 高压。高压。29YPD培养基Yeast Extract Peptone Dextrose Medium (1 liter)1% yeast extract2% peptone900 ml of water Autoclave for 20 minutes on

14、 liquid cycle.2% dextrose (glucose)， （20%储存液，抽滤灭菌）。储存液，抽滤灭菌）。Note: Add 20 g of agar if making YPD plates。30Minimal Dextrose MD平板成分：成分：1.34% YNB（yeast nitrogen base，酵母培养基酵母培养基） 4 x 10-5 % biotin 2% dextrose配制方法：配制方法：1. 800 ml 水，水， （平板加（平板加15 g agar），灭菌），灭菌 20 ；2. 冷却到冷却到 60C ， 加加100 ml of 10 X YNB，2 m

15、l of 500 X biotin，100 ml of 10 X dextrose；3. 倒平板。倒平板。31 BMGY： Buffered Glycerol-complex MediumBMMY： Buffered Methanol-complex Medium (1 liter)成分：成分：1% yeast extract 2% peptone 100 mM potassium phosphate, pH 6.0 1.34% YNB 4 x 10-5% biotin 1% glycerol （ BMGY ）or 0.5% methanol（ BMMY）32333435毕赤酵母具有高等真核表

16、达系统的许多优点：毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：1.蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。2. 操作时与操作时与E. coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。简单、廉价，且表达水平更高。3.同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。倍以至百倍。 这些使得毕赤酵母成为非常

17、有用的蛋白表达系统。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 36毕赤酵母系统的注意事项毕赤酵母系统的注意事项1. 严格无菌操作，防止污染；可以镜检2. 温度30C;3. 转化4. PCR检测5. 诱导时间37酵母蛋白糖基化酵母蛋白糖基化 酿酒酵母与毕赤酵母大多数为酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露连接糖基化高甘露糖型；糖型； 然而毕赤酵母中蛋白翻译后所增加的寡糖链长度然而毕赤酵母中蛋白翻译后所增加的寡糖链长度（平均每个支链（平均每个支链8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（的（50-150 个甘露糖残基）短得多，但比人的大；个甘露糖残基）短得多，但

18、比人的大； 酿酒酵母核心寡糖有末端酿酒酵母核心寡糖有末端-1,3聚糖聚糖连接头，而毕赤连接头，而毕赤酵母则没有。一般认为酵母则没有。一般认为-1,3聚糖接头与蛋白的聚糖接头与蛋白的超抗超抗原性原性有关，使得这些蛋白不适于治疗应用。有关，使得这些蛋白不适于治疗应用。38蛋白质糖基化 蛋白质的糖基化是真核生物的一种常见的翻译后修饰方式 ； 糖基化影响蛋白折叠、定位、转运、生物活性、可溶性、抗原性、半衰期。 39 1、N-linked glycosylation a sugar attach to the amino group of an asparagine （天冬氨酰）. sequence m

19、otif Asn-Xaa-Ser/Thr402、O-linked glycosylation, In O-glycosylation, a sugar is attached to the hydroxyl group of a serine or threonine residue. no sequence motif defined41 3、C-Mannosylation （甘露糖化） sugar is linked to the protein through a carbon-carbon bond. 42 4、 GPI anchor attachments. Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins. 糖基磷脂酰肌醇锚 binding to the plasma membrane