人类外周血淋巴细胞的培养及染色体标本制备课件.ppt

1、细胞与遗传学教研室细胞与遗传学教研室一、实验目的一、实验目的1.1.掌握人类染色体标本的制作方法掌握人类染色体标本的制作方法2.2.了解人类染色体形态结构特征了解人类染色体形态结构特征PHA37 68h秋水仙素秋水仙素至至72 h h三、实验用品三、实验用品 1.1.材料：人体外周血材料：人体外周血 2.2.器材：培养箱、培养瓶、离心机、刻度离心管、吸器材：培养箱、培养瓶、离心机、刻度离心管、吸管、恒温水浴锅等管、恒温水浴锅等 3.3.试剂：培养基、秋水仙素（试剂：培养基、秋水仙素（12.5gml12.5gml）、）、植物凝植物凝集素（集素（PHAPHA）、肝素、肝素、0.075Mkcl0.0

2、75Mkcl低渗液、甲醇、冰乙低渗液、甲醇、冰乙酸、酸、PH6.8PH6.8磷酸缓冲液、磷酸缓冲液、GiemsaGiemsa原液。原液。四、实验方法四、实验方法1.1.外周血细胞培养外周血细胞培养（1 1）采血：无菌，肝素抗凝。）采血：无菌，肝素抗凝。 用无菌注射器抽取肝素用无菌注射器抽取肝素0.2ml,0.2ml,润湿针筒润湿针筒, ,推出多推出多余肝素余肝素. .消毒后消毒后, ,抽取受试者静脉血抽取受试者静脉血2ml2ml。）（2 2）接种培养：每培养瓶加入）接种培养：每培养瓶加入0.30.5ml0.5ml（1010滴）滴）, , 接种种于装有5ml培养养基的培养瓶养瓶中，摇匀摇匀， 3

3、7培养养箱中培养养68小时时。 （2020滴）滴） （3 3）秋水仙素处理：）秋水仙素处理：0.050.4gml培养养基，轻摇轻摇混匀匀后，继续继续培养养至72小时时 。 实验方法实验方法2.2.染色体的制备染色体的制备（1）收获细胞：用吸管吸取培养物，移至离心管中，以）收获细胞：用吸管吸取培养物，移至离心管中，以1500转转/分离心分离心10分钟，弃去上清液，留下沉淀物约分钟，弃去上清液，留下沉淀物约0.3ml。 （2）低渗处理：加入预温）低渗处理：加入预温37的低渗液至的低渗液至8ml，用吸管，用吸管轻轻吹吹打混匀，置于打混匀，置于37恒温水浴锅中低渗恒温水浴锅中低渗20分钟分钟 。低渗后

4、吹打要轻轻,以防细细胞破裂.（3）预固定：缓缓加入）预固定：缓缓加入1ml新配制的固定液（甲醇：冰乙酸新配制的固定液（甲醇：冰乙酸=3:1），立即用吸管轻吹打混匀。以），立即用吸管轻吹打混匀。以1500转转/分离心分离心10分钟分钟，弃上清液，弃上清液， 留约留约0.3ml沉淀物。沉淀物。 （4）固定：加入新鲜固定液至）固定：加入新鲜固定液至8ml，吸管吹打混匀，室温固，吸管吹打混匀，室温固定定20分钟分钟， 1500转转/分离心分离心10min，去上清液。依上述方法，去上清液。依上述方法再重复固定再重复固定1次。次。 实验方法实验方法（5）制备细胞悬液：）制备细胞悬液： 预留预留0.20.3ml固定液固定液 ，加2滴新配固定液制成细胞悬制成细胞悬液液 （6）滴片：）滴片： 吸取细胞悬液，滴吸取细胞悬液，滴23滴于冰镇的载玻片上滴于冰镇的载玻片上,于酒精灯火于酒精灯火焰上过火后，空气干燥。焰上过火后，空气干燥。(每组每组3张，只染张，只染1张）张） （7）染色：）染色： Giemsa染液染色10分钟钟，自来来水轻轻冲洗，晾晾干，镜检镜检。 五、实验结果五、实验结果 在低倍镜下选择分散良好，长度适中的分在低倍镜下选择分散良好，长度适中的分裂相，再转至油镜观察。裂相，再转至油镜观察。