免疫学检测原理课件.ppt

1、免疫学检测原理免疫学检测原理第二十二章第二十二章 概述概述 抗原抗体的检测技术抗原抗体的检测技术 免疫细胞的检测免疫细胞的检测 细胞因子及其受体的检测细胞因子及其受体的检测 粘附分子的检测粘附分子的检测 免疫相关基因的检测免疫相关基因的检测 免疫标记技术免疫标记技术 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测主主要要内内容容 免疫学检测是应用免疫学理论设计免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。物学技术在免疫学研究中的应用。 免疫学技术的应用极为广泛免疫

2、学技术的应用极为广泛, , 疾病疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。的诊断、疗效评价及理论研究等。 一、概一、概 述述 概述概述 抗原抗体的检测技术抗原抗体的检测技术 免疫细胞的检测免疫细胞的检测 细胞因子及其受体的检测细胞因子及其受体的检测 粘附分子的检测粘附分子的检测 免疫相关基因分析免疫相关基因分析 免疫标记技术免疫标记技术 免疫免疫PCR(IM-PCR)技术技术 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测主主要要内内容容 * 根据反应的基本原理与表现主根据反应的基本原理与表现主要分为凝集反应、沉淀反应和补要分为凝集反应、沉淀反应和补体参与的各种反应。体参与的各种反应。 * 根据抗原抗体反应设计的试验根

3、据抗原抗体反应设计的试验还有标记抗原还有标记抗原(或抗体或抗体)检测相应物检测相应物质的标记技术。质的标记技术。二、抗原抗体的检测技术二、抗原抗体的检测技术抗原抗体的检测方法抗原抗体的检测方法凝集反应凝集反应(Agglutination)凝集试验凝集试验间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验沉淀反应沉淀反应（Precipitation)沉淀反应沉淀反应单扩与双扩单扩与双扩原理原理单向琼脂糖单向琼脂糖扩散实验扩散实验双扩实验双扩实验结果分析结果分析火箭电泳火箭电泳对流免疫电泳对流免疫电泳补体结合试验补体结合试验Western Blot 检测检测HIV一、概述一、概述二、抗原抗体的检测技术二、抗原抗体的

4、检测技术三、免疫细胞的检测三、免疫细胞的检测四、细胞因子及其受体的检测四、细胞因子及其受体的检测五、粘附分子的检测五、粘附分子的检测六、免疫相关基因分析六、免疫相关基因分析七、免疫标记技术七、免疫标记技术八、免疫八、免疫PCR(IM-PCR)技术技术 九、细胞凋亡的检测九、细胞凋亡的检测主主要要内内容容 对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定,计数及功能测定。计数及功能测定。 (一一) 淋巴细胞及亚群的分离淋巴细胞及亚群的分离三、免疫细胞的检测三、免疫细胞的检测 (1) 抗凝抗凝静脉血静脉血(2) 加等加等量量NS(4) 密度梯度离心密度梯度离心血浆血浆分离液分离液R

5、BCPBMCPMN(3) 混匀后，缓混匀后，缓慢加于分离液上慢加于分离液上E花环实验花环实验利用表面标志分利用表面标志分离淋巴细胞亚群离淋巴细胞亚群流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry, FCM)流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理FACS细胞分选细胞分选FACS 技术分析技术分析用抗用抗IgM单抗分单抗分离离B细胞克隆细胞克隆Removal of T cells from marrow graft MagnetMagnetic antibodies(二二) 免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定 1. T细胞功能测定：细胞功能测定： 可分为非特异性丝裂可分为非特异性丝裂原和特异性

6、抗原两类。原和特异性抗原两类。 * 丝裂原主要有丝裂原主要有PHA、Con A和和PWM； * 抗原刺激物有破伤风类毒素、抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念和白色念珠菌等；珠菌等； * 同种同种MHC及抗及抗CD3单抗等单抗等 * 肿瘤细胞肿瘤细胞-自体淋巴细胞混合培养自体淋巴细胞混合培养淋巴细胞转化试验（形态学示意图）淋巴细胞转化试验（形态学示意图） PHA刺激刺激4872小时小时培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性淋巴细胞增殖试验（淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法）示意图掺入法）示意图靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混

7、合培养4-6小时细胞毒试验（细胞毒试验（51Cr释放法）示意图释放法）示意图 * * 移植物抗宿主反应移植物抗宿主反应(GVHR) (GVHR) * * 迟发型超敏反应迟发型超敏反应(DTH) (DTH) 2. B细胞功能判定细胞功能判定 ( 一种可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分一种可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。泌量的体外实验方法。 溶溶血血空空斑斑实实验验ELISPOT实验实验 稳定、特异，且抗原用量少；稳定、特异，且抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的可同时检测不同抗原诱导的 抗体分泌，并可定量检测抗体分泌，并可定量检测 可检测组织切片中分泌抗体可检测组织切片中

8、分泌抗体的单个细胞的单个细胞3. NK细胞活性测定细胞活性测定 用放射性核素用放射性核素(51Cr、125I UdR)标记靶细胞。标记靶细胞。测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中的测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中的乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH)活性。活性。 4吞噬细胞功能测定吞噬细胞功能测定 滤膜渗透法滤膜渗透法(Boyden小室法小室法) 。 1) 显微镜检法显微镜检法 2) NBT试验试验 3) 化学发光测定法化学发光测定法一、概述一、概述二、抗原抗体的检测技术二、抗原抗体的检测技术三、免疫细胞的检测三、免疫细胞的检测四、细胞因子及其受体的检测四、细胞因子及其受体的检测五、粘附分子

9、的检测五、粘附分子的检测六、免疫相关基因分析六、免疫相关基因分析七、免疫标记技术七、免疫标记技术八、细胞凋亡的检测八、细胞凋亡的检测主主要要内内容容 细胞因子及其受体的检测细胞因子及其受体的检测 l 免疫学检测法免疫学检测法l 生物学测定法生物学测定法l 分子生物学测定法分子生物学测定法l 细胞因子受体检测的基本技术细胞因子受体检测的基本技术 免疫学检测的基本原理是将细胞因免疫学检测的基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。如免疫斑子作为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、点法、ELISA法、法、RIA法和免疫印迹法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。某些法等均已用于细胞因子的检测。某些细胞因

10、子含量甚微的样品细胞因子含量甚微的样品(如脑脊液如脑脊液)可用免疫聚合酶链反应可用免疫聚合酶链反应(immuno-PCR)进行检测。进行检测。免疫学检测法免疫学检测法 根据细胞因子对特定的生物学活根据细胞因子对特定的生物学活性性,应用相应的指示系统应用相应的指示系统,同时与标同时与标准品对比测定准品对比测定,从而得知样品中细胞从而得知样品中细胞因子的活性水平因子的活性水平, 一般以活性单位一般以活性单位(U/ml)表示。表示。生物学测定法生物学测定法1 1、促进细胞增殖和增殖抑制法、促进细胞增殖和增殖抑制法 3H-TdR掺入法、掺入法、 比色法（比色法（ MTT、WST-1） 染色法染色法 直

11、接计数法直接计数法2 2、细胞毒活性测定法、细胞毒活性测定法 51Cr释放释放 比色法（比色法（ MTT、WST-1）3 3、集落形成法、集落形成法4 4、细胞病变抑制法、细胞病变抑制法5 5、趋化活性测定法、趋化活性测定法分子生物学测定法分子生物学测定法 RNA印迹法、核酸酶保护分析、原印迹法、核酸酶保护分析、原位杂交、位杂交、PCR和和Real Time PCR等。亦等。亦可通过检测细胞内细胞因子的基因组成可通过检测细胞内细胞因子的基因组成或或mRNA量，推算出细胞因子的合成量。量，推算出细胞因子的合成量。 CKR检测的基本技术检测的基本技术 细胞因子的广泛生物学活性是通细胞因子的广泛生物

12、学活性是通过与各自相应的受体结合而发挥的。过与各自相应的受体结合而发挥的。因此细胞因子受体的检测与细胞因因此细胞因子受体的检测与细胞因子检测一样，已成为基础理论和临子检测一样，已成为基础理论和临床免疫学研究的一个重要内容。床免疫学研究的一个重要内容。 一、概述一、概述二、抗原抗体的检测技术二、抗原抗体的检测技术三、免疫细胞的检测三、免疫细胞的检测四、细胞因子及其受体的检测四、细胞因子及其受体的检测五、粘附分子的检测五、粘附分子的检测六、免疫相关基因分析六、免疫相关基因分析七、免疫标记技术七、免疫标记技术八、细胞凋亡的检测八、细胞凋亡的检测主主要要内内容容 粘附分子的检测粘附分子的检测 某些粘附

13、分子除表达于细胞膜表面某些粘附分子除表达于细胞膜表面外，还以可溶性形式存在于体液中。外，还以可溶性形式存在于体液中。粘附分子的检测方法目前大多采用免粘附分子的检测方法目前大多采用免疫学技术检查其在细胞膜上的分布和疫学技术检查其在细胞膜上的分布和测定某些样品中的含量。测定某些样品中的含量。一、概述一、概述二、抗原抗体的检测技术二、抗原抗体的检测技术三、免疫细胞的检测三、免疫细胞的检测四、细胞因子及其受体的检测四、细胞因子及其受体的检测五、粘附分子的检测五、粘附分子的检测六、免疫相关基因分析六、免疫相关基因分析七、免疫标记技术七、免疫标记技术八、细胞凋亡的检测八、细胞凋亡的检测主主要要内内容容 免

14、疫相关基因分析免疫相关基因分析 * * 包括各种类型的杂交技术，如转印杂交、包括各种类型的杂交技术，如转印杂交、斑点杂交、原位杂交等以及斑点杂交、原位杂交等以及PCRPCR技术等。技术等。 * * 杂交技术主要工具是核酸探针，它是指一杂交技术主要工具是核酸探针，它是指一段用放射性核素或其他标记物段用放射性核素或其他标记物( (生物素、荧光生物素、荧光素、地高辛等素、地高辛等) )标记，并与目的基因互补的标记，并与目的基因互补的DNADNA片段或单链片段或单链DNADNA、RNARNA。分为。分为cDNAcDNA探针、寡探针、寡核苷酸探针、基因组核苷酸探针、基因组DNADNA探针及探针及RNAR

15、NA探针等。探针等。一、细胞因子基因组一、细胞因子基因组DNA或或mRNA的检测的检测 1. Northern杂交分析杂交分析 2. 斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交: 将将DNA变性后直接点样变性后直接点样于硝酸纤维膜上再进行杂交于硝酸纤维膜上再进行杂交 3. 原位杂交法原位杂交法 4. PCR扩增产物杂交分析：扩增产物杂交分析：将细胞因子的将细胞因子的mRNA经过逆转录为经过逆转录为cDNA，用特异性细胞因子引物，用特异性细胞因子引物进行进行PCR扩增，通过扩增，通过Southern blot后，再用标后，再用标记探针检测特异细胞因子记探针检测特异细胞因子DNA的水平。的水平。 5So

16、uthern印迹杂交印迹杂交 二、二、BCR及及TCR克隆性基因重排分析克隆性基因重排分析1Southern印迹杂交法：印迹杂交法： 仅适用于科研，而不适用于临床诊断。仅适用于科研，而不适用于临床诊断。2. PCR扩增技术扩增技术: PCR扩增技术扩增技术: 正常多克隆淋巴细胞群正常多克隆淋巴细胞群DNADNA的的扩增产物含有不同长度的片段，电泳检查呈现扩增产物含有不同长度的片段，电泳检查呈现弥漫涂片状结构或多条带。而单克隆性基因重弥漫涂片状结构或多条带。而单克隆性基因重排经排经PCRPCR扩增后，产生明显相同长度的片段，扩增后，产生明显相同长度的片段，电泳呈现单一紧密折带状结构。电泳呈现单一

17、紧密折带状结构。应用应用PCR 扩增技术进行基因诊断具有特异、扩增技术进行基因诊断具有特异、敏感敏感(1/1041/105克隆性细胞克隆性细胞)、快速、快速(24h可完可完成成)等优点。等优点。用于恶性淋巴瘤和白血病等的临床诊断以用于恶性淋巴瘤和白血病等的临床诊断以及白血病治疗后微小残留病灶的检测及白血病治疗后微小残留病灶的检测。 三、三、HLA基因分型技术基因分型技术1序列特异性寡核苷酸探针序列特异性寡核苷酸探针PCR(PCR-SSOP)或或PCR-ASO:应用最多的一种简单、快速而又精确的应用最多的一种简单、快速而又精确的HLA-类抗原分型方法，能鉴定所有已知序列的类抗原分型方法，能鉴定所

18、有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因，精确地分析等位基因，精确地分析DNA的多态性。的多态性。2限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP)技术：此项技技术：此项技术特别适用于个别标本和小样本的检测。术特别适用于个别标本和小样本的检测。3单链构象多态性单链构象多态性PCR ( PCR-SSCP ) ：藉此可鉴别藉此可鉴别编码编码HLA-类抗原基因的多态性。类抗原基因的多态性。 应用应用PCR-SSCP可以直接比较供、受体之间可以直接比较供、受体之间HLA-类基因是否完全一致，且可精确到类基因是否完全一致，且可精确到1 2个碱基之差，个碱基之差，具有相对简捷而精确的特点

19、。在异基因骨髓移植的配具有相对简捷而精确的特点。在异基因骨髓移植的配型中已初步应用于临床。型中已初步应用于临床。4序列特异性引物序列特异性引物PCR技术技术(PCR-SSP)：该法操作该法操作简单、快速、实验结果容易判断，杂合子也很易检简单、快速、实验结果容易判断，杂合子也很易检出。不足之处在于，为检出所有的等位基因必须用出。不足之处在于，为检出所有的等位基因必须用多个引物进行扩增。多个引物进行扩增。5指纹图谱指纹图谱 (PCR-fingerprinting)技术技术|：进行：进行HLA-基因分型鉴定时，将供、受体的基因分型鉴定时，将供、受体的DNA扩增产扩增产物混合，电泳后得出一指纹图，再与

20、二者各自的物混合，电泳后得出一指纹图，再与二者各自的PCR指纹图谱进行比较，从中选择出指纹图一致的指纹图谱进行比较，从中选择出指纹图一致的供、受体进行移植。供、受体进行移植。 * PCR指纹图谱在选择非亲缘关系的供、受体进指纹图谱在选择非亲缘关系的供、受体进行骨髓和器官移植配型时，可以节省大量时间。行骨髓和器官移植配型时，可以节省大量时间。6. SNP(单个核苷酸多态性单个核苷酸多态性)分析分析一、概述一、概述二、抗原抗体的检测技术二、抗原抗体的检测技术三、免疫细胞的检测三、免疫细胞的检测四、细胞因子及其受体的检测四、细胞因子及其受体的检测五、粘附分子的检测五、粘附分子的检测六、免疫相关基因分

21、析六、免疫相关基因分析七、免疫标记技术七、免疫标记技术八、细胞凋亡的检测八、细胞凋亡的检测主主要要内内容容免疫标记技术免疫标记技术 l 免疫荧光技术免疫荧光技术 l 放射免疫分析法放射免疫分析法 l 酶免疫技术酶免疫技术l 发光免疫测定发光免疫测定标记技术检测抗原标记技术检测抗原免免疫疫标标记记技技术术检检测测抗抗体体免疫荧光实验免疫荧光实验直接与间接免疫荧光实验直接与间接免疫荧光实验ELISA实验实验抗抗原原竞竞争争抑抑制制实实验验验验 Ag* Ab Ag 标记抗原 特异性抗体 待测抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗体复合物分离Ag*-Ab 和游离Ag*从标准曲线上读知含量测定

22、Ag*-Ab和/或游离Ag*放射性 放射免疫测定法放射免疫测定法(RIA)示意图示意图一、概述一、概述二、抗原抗体的检测技术二、抗原抗体的检测技术三、免疫细胞的检测三、免疫细胞的检测四、细胞因子及其受体的检测四、细胞因子及其受体的检测五、粘附分子的检测五、粘附分子的检测六、免疫相关基因分析六、免疫相关基因分析七、免疫标记技术七、免疫标记技术八、细胞凋亡的检测八、细胞凋亡的检测主主要要内内容容l 形态学方法形态学方法l普通光学显微镜检测法普通光学显微镜检测法l荧光显微镜检测法荧光显微镜检测法 材料：材料：石蜡切片石蜡切片; ;冰冻切片冰冻切片; ;细胞学涂细胞学涂 方法方法: :电镜观察凋亡小体

23、电镜观察凋亡小体l 生化学方法生化学方法l 免疫学方法免疫学方法l 末端标记法末端标记法 形态学方法：形态学方法： PI染液：碘化丙啶染液：碘化丙啶(propidium iodide,PI)；核红色核红色 DAPI染液；染液；核蓝白色核蓝白色 AO染液：染液：核黄绿色核黄绿色* 凋亡细胞呈现核浓缩凋亡细胞呈现核浓缩, 染色加深染色加深,凋亡小体。凋亡小体。 凋亡的形态学检测凋亡的形态学检测U937 Cell（DAP1染色）染色）大鼠结肠组织大鼠结肠组织（AZON染色）染色） 生化学方法电泳法生化学方法电泳法DNA Ladder电泳图谱电泳图谱原位末端转移酶标记技术原位末端转移酶标记技术 (TdT或或TUNEL) 凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活, , 核核DNADNA被切割成许多双链被切割成许多双链DNADNA片段以及高分子片段以及高分子量量DNADNA单链断裂点单链断裂点( (缺口缺口), ), 暴露出大量暴露出大量33羟羟基末端基末端, , 如用如用(TdT)(TdT)将标记的将标记的-dUTP-dUTP进行缺口进行缺口末端标记末端标记, , 则可原位特异地显示出凋亡细胞。则可原位特异地显示出凋亡细胞。 (一一)荧光标记法荧光标记法 (二二)酶标记法酶标记法 检测原理及方案检测原理及方案U937细胞（荧光素染色）细胞（荧光素染色）