PCR技术在临床中的应用-肿瘤个性化治疗课件.ppt

1、PCR技术在临床中的应用这里写讲者姓名这里写讲者信息1这里写讲者信息2目录目录1、PCR技术背景九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开1998年 荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测PCR (Polymerase Chain Reaction)1983 Cetus 公司的 Kary Mullis于12月16日第一 次成功实验发明了PCR1985 关于PCR 的文章首次由 Kary Mullis及其同事等人 在Science上 发 表1989 12月Science杂志将PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993 Kary Mullis，Nobel Prize

2、 in Chemistry 1995 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量PCR技术 循环次数循环次数 DNA的链数的链数 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20 220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10亿亿 PCR循环次数与循环次数与DNA产量关系产量关系PCR特点：高效扩增、忠实复制特点：高效扩增、忠实复制 灵敏度高灵敏度高 快捷快捷 简便简便 对样品纯度要求低对样品纯度要求低 可以相对定量可以相对定量PCR反应的特点Ct值的意义Ct值与重复性值与重复性同一样本在相同条件下同时进行同一样本在相同条件下同时进行96次次

3、扩增扩增FQ-PCRCt值与浓度值与浓度不同的模板达到荧光域值时的不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同值不同2、PCR技术在临床常规检测中的应用荧光定量荧光定量PCR的临床应用的临床应用 1. 病原体含量与病情之间的关系 2. 病原体含量与用药之间的关系 3. 药物及疗法的研究与开发 4. 新的病原体分子诊断标准 5. 新的愈后指标 6. 传染病发病的监控、预测与预防1. 肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等2. 肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因（a、b-地中海贫血、唐氏综合症、性别连锁遗传病地中海贫血、唐氏综合症、性别连锁遗传病）1

4、. 等位基因检测2. 多基因遗传病的突变检测3. 基因表达异常所致遗传病检测3、PCR技术在肿瘤个性化治疗中的应用p EGFR基因突变检测基因突变检测p KRAS基因突变检测基因突变检测p BRAF基因突变检测基因突变检测p 二氢嘧啶脱氧酶（二氢嘧啶脱氧酶（DPD）基因突变检测）基因突变检测p UGT1A1基因多态性检测基因多态性检测 肺癌居于我国恶性肿瘤死亡率之首，每年新增60万患者，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占85%。晚期NSCLC的治疗史197019802011200019902013厄洛替尼2004顺铂1978卡铂1989紫杉醇1998吉非替尼2002埃克替尼2011最佳支持治疗铂

5、类单药化疗双药联合化疗靶向治疗化疗+靶向治疗2-468-1012+XX+中位生存（月）中位生存（月）晚期NSCLC的治疗现状病理分型病理分型分子分型分子分型腺癌腺癌大细胞癌大细胞癌鳞癌鳞癌鳞癌鳞癌未知未知EGFR1EGFRvIIIPI3KCAEGFR TKDDR2INSR腺癌腺癌K-ras未知未知EGFRB-rafFGFRPDGFRVEGFRAKTRETEGFR基因突变检测是NSCLC靶向用药的必检项目IPASS: 根据突变状态的疗效分析根据突变状态的疗效分析04812162024Time from randomisation (months)0.00.20.40.60.81.0Probabi

6、lityof PFSGefitinib EGFR M+ (n=132)Gefitinib EGFR M- (n=91)Carboplatin / paclitaxel EGFR M+ (n=129)Carboplatin / paclitaxel EGFR M- (n=85)Gefitinib EGFR M+ (n=132)Gefitinib EGFR M- (n=91)Carboplatin / paclitaxel EGFR M+ (n=129)Carboplatin / paclitaxel EGFR M- (n=85)为什么要检测EGFR突变？EGFR酪氨酸激酶区突变种类EGFR突变类

7、型与吉非替尼治疗敏感性组别组别突变类型突变类型所占比例所占比例对吉非替尼敏感性对吉非替尼敏感性1Exon 19 deletions; L858R90%敏感敏感2T790M/deletions; T790M/L858R; G719X; L861Q; S768I7%敏感敏感，数据，数据有限有限3T790M alone; Exon 20 insertions; other mutations3%不不敏感敏感 K-ras基因是编码一个GTP结合蛋白的癌基因，其表达产物是EGFR信号传导通路上的重要蛋白。 K-ras基因突变一般会使结直肠癌和肺癌患者络氨酸激酶抑制剂产生耐药。为什么进行KRAS基因检测？

8、为什么要进行K-ras基因检测？用药原则： 08年NCCN结直肠癌临床实践指南指出：所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态；只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂（西妥昔单抗和帕尼单抗）或与化疗联合治疗。 09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南明确指出：当K-RAS基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯（Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib）进行分子靶向治疗。7个检测位点外显子外显子（突变位点数目（突变位点数目）位点名称位点名称络氨酸及酶抑制络氨酸及酶抑制剂剂12（6）KM1耐药KM2耐药KM3耐药KM4耐药KM5耐药KM6耐药13（1）KM7耐药黑色素瘤概况黑

9、色素瘤概况 恶性黑色素瘤(黑色素瘤)是临床上较为常见的皮肤粘膜和色素膜恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为35。2010年全球黑色素瘤新发病例199 627例，死亡例数为46372例1。 虽然黑色素瘤在我国发病率较低，但近年来成倍增长，每年新发病例约2万例1。1CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(201 1版)，临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期BRAF基因与黑色素瘤基因与黑色素瘤 检测我国468例原发黑色素瘤标本，BRAF突变率为25,9其中BRAFV600E是最常见的突变位点(87)，这为中国患者使用BRAFV600E抑制剂(Vemurafenib)提

10、供了理论基础1。 在103个治疗中心共入组了675例不能手术切除的期或期的初治黑色素瘤患者，结果Vemurafenib组的客观有客观有效率达到效率达到48而达卡巴嗪(DTIC)组仅5.5，故在指南中也将Vemurafenib作为BRAFV600E 突变患者的一类证据推荐。1CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(201 1版) 临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期丝裂原活化蛋白激酶丝裂原活化蛋白激酶( MAPK) 信号转导通路信号转导通路 该通路在细胞的生长、分化和增殖中起着重要作用，通路通过 as、af、有丝分裂原活化蛋白激酶( MEK)及胞外信号调节激酶( EK) 的特异性级

11、联磷酸化将信号由细胞外传入细胞核内2。2董高超，周 湘，唐伟方，陆 涛.B-af 激酶抑制剂的研究进展J中国药科大学学报2014，45( 1) : 1 9.BRAF基因基因 RAF激酶家族有3个亚型: ARAF、BRAF和CRAF。这 3 个亚型均有 3 个保守区域 CR)：CR1、CR2 和 CR3。 研究表明BRAFV600E的催化活性比野生型野生型 B-af 活性高活性高 500 倍倍33Wan PTC，Garnett MJ，oe SM，et al Mechanism of activation ofthe AF-EK signaling pathway by oncogenic mut

12、ations ofB-AFJ Cell，2004，116( 6) : 855 867.DPD 个体差异个体差异:正常正常vs不足反应不足反应7/13/202236DPD基因变异的多态分布7/13/202237van Kuilenburg, 2004, Dihydropyrimidine dehydrogenase and the efficacy and toxicity of 5-fluorouracil, European Journal of Cancer，40(7): 939-950 UGT1A1突变型的伊立替康毒副反应7/13/202239UGT1A1*28导致导致UGT1A1表达减

13、少表达减少30%80%，SN-38G水平降低水平降低,使使UGT1A1*28 变异患者腹泻和粒细胞减少变异患者腹泻和粒细胞减少危险性增高。危险性增高。4、PCR技术在其他个性化治疗中的应用一、CYP2C19基因多态性检测CYP2C19基因分型氯吡格雷等p CYP2C19基因编码的S-美芬妥英羟化酶，是体内药物代谢的主要酶系的成员之一。p 经由S-美芬妥英羟化酶代谢的临床常用药物，包括氯吡格雷、伏立康唑、质子抑制剂类药物、抗抑郁类药物、以及抗癫痫类药物等。检测的CYP2C19基因分型S-美芬妥英羟化酶*1(野生型)正常酶活*2(c.681GA)酶丧失活性*3(c.636GA)酶丧失活性东方人弱代

14、谢表型(PM)的99以上p 氯吡格雷（波立维）是目前世界范围内使用最广泛的噻吩吡啶类抗血小板药，用于急性冠脉综合征、冠脉支架术和冠心病的一级二级预防，可以减少心血管疾病患者心脏病发作、卒中以及死亡的风险。FDA建议药师可以通过检测CYP2C19的基因型来了解患者波立维的代谢能力，对于波立维弱代谢者可给患者选用其它抗凝血药物。CYP2C19基因分型检测CYP2C19属于CYP2家族的15个亚家族成员之一。其主要编码的S-美芬妥英羟化酶代谢一系列临床上的常用药物，在肝脏中有很多表达。血小板凝集抑制剂氯吡格雷质子泵抑制剂奥美拉唑；兰索拉唑；泮托拉唑抗抑郁药氟西汀；西酞普兰；艾司西酞普兰；阿米替林；氯

15、米帕明、西咪嗪；吗氯贝胺；曲米帕明；依替唑仑抗癫痫药安定；氯巴占；苯妥英钠；苯巴比妥；丙戊酸抗肿瘤药环磷酰胺抗疟疾药氯胍抗真菌药伏立康唑孕激素黄体酮二、CYP2C9和VKORC1基因多态性检测华法林（Warfarin）在临床上常用于治疗血栓性疾病 ,是目前国内外最常用的长效抗凝药，具有抗凝和溶栓的双重作用。华法林血浆药物浓度和疗效存在明显的个体差异和种族差异。 鉴别对华法林药物敏感性增加的患者 能够快速确定华法林剂量范围 保证疗效，减少出血风险。 美国FDA批准在使用Warfarin前需检测CYP2C9和VKORC1等位基因状态CYP2C9和VKORC1基因多态性华法林敏感性Warfarin敏

16、感性基因检测检测目的基因：CYP2C9 和VKORC1 位点：5个SNP位点靶基因等位基因位点CYP450 2C9430CT(2)1075AC(3)1080CG(5)VKORC11173CT-1639GA凝血酶原时间凝血酶原时间 (PT) 国际标准化比率国际标准化比率 (INR)VKORC1、CYP2C9更有效、迅速地调整华法林维持剂量达到疗效的同时减少华法林的出血风险三、MTHFR基因多态性检测亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢中的关键酶，第677位点基因发生突变可导致酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，利用不足，可引发多种新生儿出生缺陷。中国疾病预防与控制中心、妇幼保健中心于2008年

17、发文，明确规定MTHFRC677T为妇女临床保健服务的遗传学检测项目。MTHFR（C677T）基因型酶活性中国人频率CC100%25%CT65%50%TT30%25%MTHFR（C677T）各种基因型的酶活性及中国人群分布MTHFR（C677T）基因突变高同型半胱氨酸血症MTHFR（C677T）基因突变者（TT 型）心脑血管疾病的风险显著增高p H 型高血压增加血管疾病风险 28 倍 。p MTHFR（C677T）基因 TT 型增加卒中风险 26%-50%。p MTHFR（C677T）基因 TT 型增加缺血性心脏病风险 16%，并与 Hcy 水平呈正相关。p 随着体内 Hcy 水平升高，MTHFR（C677T）基因 TT 型的危害更加突出，卒中发生率更高 。血管紧张素转化酶抑制剂（ ACEI ）治疗 MTHFR（ C677T）基因 TT 型高血压患者，舒张压下降有效率显著优于其他基因型。依叶 治疗 MTHFR（C677T）基因 TT 型高血压患者效果更佳。谢谢!