HIV检测及临床意义课件.ppt

1、.1HIV检测及临床意义中国医科大学附属一院中国医科大学附属一院艾滋病确认实验室艾滋病确认实验室尚尚 红红.2HIV的发现的发现Montagnie (LAS) 1983. Science 220: 868-871Gallo (HTLV) 1983. Science 220: 865-86 Levy (ARV) 1984. Science 225: 840-842 1986 1986 国际病毒分类委员会国际病毒分类委员会： HIV HIV-2 1986 西非西非.3中国每年新发现的中国每年新发现的HIV/AIDS病例数（病例数（19852002）0 05000500010000100001500

2、015000病例数病例数年份年份AIDSHIV(+)AIDS1020023523295238126 136 230 125 947 1045HIV(+)5197171 299 216 261 274 531 1567 2649 33433306 4677 4527 13429824198519861987198819891990199119921993199419951996199719981999200020012002.4HIV感染可通过两种途径检测感染可通过两种途径检测直接检测病毒或其组成部分直接检测病毒或其组成部分检测人体检测人体HIV免疫反应免疫反应HIV特异性抗体特异性抗体从感染到

3、血清抗体阳转有一段窗口期，平均为从感染到血清抗体阳转有一段窗口期，平均为1-31-3个个月，有一小部分月，有一小部分HIV感染者出现延迟反应感染者出现延迟反应.5HIVHIV感染后抗原和抗体的变化感染后抗原和抗体的变化及其与疾病关系及其与疾病关系HIVHIV感染人体后出现一过性病毒血症，感染人体后出现一过性病毒血症，6-86-8周后血清周后血清抗体阳转，病毒滴度降低，在随后的抗体阳转，病毒滴度降低，在随后的5-85-8年无症状年无症状带毒期里带毒期里HIVHIV抗体一直存在，但病毒难查到。进入抗体一直存在，但病毒难查到。进入AIDSAIDS期后血浆中病毒再次出现。期后血浆中病毒再次出现。故诊断

4、故诊断HIVHIV感染多数时间用抗体检测诊断，极早期感染多数时间用抗体检测诊断，极早期（窗口期）用抗原检测。（窗口期）用抗原检测。.6HIV抗体诊断抗体诊断 目前临床上实际应用的是测定特异目前临床上实际应用的是测定特异性性HIV抗体，包括抗体，包括初筛初筛和和确认确认实验。实验。.7一、检测试剂一、检测试剂l 筛查试剂必须是筛查试剂必须是HIV-1/2混合型、经国家药品监混合型、经国家药品监督管理局注册批准、批批检合格、临床评估质督管理局注册批准、批批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。量优良、在有效期内的试剂。l 目前常用的筛查试剂有目前常用的筛查试剂有酶联免疫酶联免疫、颗粒凝集颗粒

5、凝集和和其它其它快速诊断试剂快速诊断试剂。采供血机构进行血液筛查。采供血机构进行血液筛查应采用酶联免疫试剂。应采用酶联免疫试剂。l 自采自供血的单位必须进行自采自供血的单位必须进行HIV抗体检测，在抗体检测，在尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区可由经尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区可由经过培训的技术人员在规定的场所用快速试剂进过培训的技术人员在规定的场所用快速试剂进行血液筛查。行血液筛查。.8.9lELISA方法：方法：目前目前最常用的初筛实验最常用的初筛实验，自，自19851985年首次年首次检测检测HIV-1抗体的试剂盒供市以来，已从抗体的试剂盒供市以来，已从第一代的全病毒抗原间接法发展

6、到第四第一代的全病毒抗原间接法发展到第四代的以重组的多肽抗原及抗代的以重组的多肽抗原及抗P24P24抗体包被抗体包被的双夹心法，使窗口期缩短了的双夹心法，使窗口期缩短了2-32-3周。周。.10四代艾滋病酶联免疫试剂比较solidphasespecificdetection ofconjugate第一代第一代病毒裂解液病毒裂解液HIV-1IgG 抗体抗体HIV-1 -IgG抗体抗体第二代第二代病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2IgG 抗体抗体HIV-1 / -2 IgG抗体抗体第三代第三代病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2 /

7、 -OIgM / IgG 抗体抗体HIV-1 / -2 / -O病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -O第四代第四代病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -Oanti-p24 AbIgM / IgG 抗体抗体HIV-1 / -2 / -Op24 抗原抗原病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -Oanti-p24 抗体抗体Closing the window4th gen3rd gen= =1st-2nd genHIV antigenIgM abIgG abDetection limit

8、10001000）提示感染发生的）提示感染发生的可能性非常大。可能性非常大。 使用此指标应综合其他检测数据和样品背景情况进行综使用此指标应综合其他检测数据和样品背景情况进行综合分析与判断。合分析与判断。 .242、窗口期辅助诊断 在窗口期抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高在窗口期抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高峰，通常此高峰高于发病时的血浆病毒水平，早期病峰，通常此高峰高于发病时的血浆病毒水平，早期病毒毒RNARNA测定具有特殊的意义。测定具有特殊的意义。 目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行多个样品混合后的多个样品混合后的RN

9、ARNA检测以降低窗口期传播的残余危检测以降低窗口期传播的残余危险度。险度。.253、病程监控 由于由于HIVHIV感染发生后病毒载量的变化具有一定规律，并感染发生后病毒载量的变化具有一定规律，并且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。 通常在感染后无症状期内发生的临床症状很难与通常在感染后无症状期内发生的临床症状很难与AIDSAIDS发病时的症状区别，病毒载量测定可以帮助医生判断发病时的症状区别，病毒载量测定可以帮助医生判断一个刚发生的症状是否与一个刚发生的症状是否与HIVHIV感染有关。感染有关。.264、指导治疗方案及疗效测定并非在任何情况下感染者

10、都应该并非在任何情况下感染者都应该进行抗病毒治疗，这不但是经济进行抗病毒治疗，这不但是经济上的原因，更重要的是在于抗病上的原因，更重要的是在于抗病毒药物的副作用和疗效。通常在毒药物的副作用和疗效。通常在病毒载量达到一定水平后（如病毒载量达到一定水平后（如35000-5000035000-50000拷贝拷贝/ /毫升）才具毫升）才具有良好的效果。有良好的效果。只有通过治疗后病毒水平的检测只有通过治疗后病毒水平的检测才能确定治疗是否有效，通常治才能确定治疗是否有效，通常治疗后病毒水平降低疗后病毒水平降低50%50%才被认为才被认为临床有效。临床有效。Treatment Observation100

11、10001000010000010000001000000004812162024283236404448WeeksMedian HCV RNA (copies/mL).通过监测病毒滴度反映疗效通过监测病毒滴度反映疗效5、预测疾病进程、预测疾病进程 HIVHIV疾病进程与病毒载量疾病进程与病毒载量的关系十分密切，观察的关系十分密切，观察感染者病毒感染者病毒RNARNA水平可大水平可大致预测其发病的可能。致预测其发病的可能。如右图所示，病毒载量如右图所示，病毒载量与与6 6年发病率的关系为：年发病率的关系为： 5003000030000时则为时则为80%80%。.28定性检测定性检测 HIVHI

12、V核酸检测有定性和定量两类，定性检测用于核酸检测有定性和定量两类，定性检测用于HIVHIV感染的辅助诊断。通常使用感染的辅助诊断。通常使用PCRPCR或或RT-PCRRT-PCR技术，技术，使用分子生物学实验室通用的扩增试剂，引物可使用分子生物学实验室通用的扩增试剂，引物可来自文献或自行设计，应尽量涵盖所有的或常见来自文献或自行设计，应尽量涵盖所有的或常见的毒株，也可使用复合引物。的毒株，也可使用复合引物。.29 定量检测定量检测定量检测常用于监测定量检测常用于监测HIVHIV感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。目前常用的目前常用的HIV RNAHIV RNA定

13、量测定方法有逆转录定量测定方法有逆转录PCRPCR实验（实验（RT-PCRRT-PCR）、）、核酸序列扩增实验（核酸序列扩增实验（NASBANASBA）、分支）、分支DNADNA杂交实验（杂交实验（bDNAbDNA）等，这）等，这几种进口试剂盒的最低检测限为几种进口试剂盒的最低检测限为20-5020-50拷贝拷贝/ /毫升毫升按照仪器读数报告结果，应注明使用的试验方法、样品种类和样按照仪器读数报告结果，应注明使用的试验方法、样品种类和样品量。品量。测定结果小于最低检测限时，应注明最低检测限水平。注意低于测定结果小于最低检测限时，应注明最低检测限水平。注意低于最低检测限的结果不能排除最低检测限的

14、结果不能排除HIVHIV感染。感染。应附上仪器打印的数据。应附上仪器打印的数据。.30 RocheBayer (前前Chiron)Organon技术技术RT-PCRbDNANuclisens HIV-1 QT结果结果比较比较约2xbDNA 2.0 2.0版结果约为RT-PCR的50%， 3.0版结果与Roche 基本相同与Roche 基本相同优点优点通过了 FDA认证假阳性结果较bDNA少1.5版对A-G亚型有较好的反应性操作时间较少对A-G亚型有较好的反应性通过了 FDA认证 可使用多种组织，如生殖道分泌液 对A-G亚型有较好的反应性检测范围大缺点缺点l操作容易污染l测定范围较小（相对于NA

15、SBA）l少数生物样品反应受抑制，如精液、乳汁和唾液l早期版本对部分亚型反应性较差，1.0版对非B亚型的样品反应性普遍较差，（5）版通过改进l对O亚型检测能力较差l对低值样品检测的特异性较差。l无内部质量控制，尤其在3.0版中为单孔检测时，无法控制由于提取或加样操作的失误。l不同版本间差异较大，2.0版约为RT-PCR50%，3.0版结果与Roche 基本相同表明两个版本间差异可能达到50%。l对除血浆、血清外的大部分体液样品无法进行检测。l对抗凝剂敏感，只能使用EDTA。l早期版本（NASBA）对部分亚型（G亚型）反应性差。l操作复杂，样品提取(不使用自动提取仪时)和测定反应时需要进行大量的

16、手工操作。l不适合一次大量检测，ECL读数仪每次只能进行12个样品的检测。l实验内、外误差相对较大。检测检测范围范围标准版 (Amplicor 1.0 及 1.5)400 - 750,000 c/mL 超敏版 (Ultra-Direct 1.0 and 1.5):50-75,000 c/mLbDNA 3.0版:100-500,000 c/mLNuclisens HIV-1 QT: 40-10,000,000 c/mL (取决于样品量)各种各种HIV定量检测方法的比较定量检测方法的比较.31关于不同关于不同HIVHIV定量检测方法的选择定量检测方法的选择 目前用于统一不同定量方法检测值的标准品还

17、没有问世 不同定量方法结果之间还无法直接比较 同一病人治疗前后建议用同一方法进行HIV定量检测.32.33v随着政府加速对国产抗艾滋病药物上市的随着政府加速对国产抗艾滋病药物上市的批准，我国艾滋病人的治疗已经出现了曙批准，我国艾滋病人的治疗已经出现了曙光。光。v艾滋病临床治疗中各种艾滋病临床治疗中各种免疫指标免疫指标(CD4+、CD8+T细胞细胞 等等)对于确定感染状态、预测对于确定感染状态、预测发病、评价药物疗效及新药开发具有重要发病、评价药物疗效及新药开发具有重要的作用。的作用。 .34CD4 T淋巴细胞淋巴细胞：（流式细胞术）（流式细胞术）CD4 T细胞是细胞是HIV的主要靶细胞的主要靶

18、细胞, ,感染后感染后随着病程进展，随着病程进展，CD4 T细胞不断下降细胞不断下降 500/ 500/mm3 3有临床诊断意义有临床诊断意义 200/ 200/mm3 3AIDS CDC 病程进展，病程进展， AIDS诊断和疗效观察的指标诊断和疗效观察的指标.35HIVHIV感染几周内，出现类流感症状，也称为血清阳转期感染几周内，出现类流感症状，也称为血清阳转期， CD4CD4细胞的数量降低。随之出现的免疫应答可以控制急细胞的数量降低。随之出现的免疫应答可以控制急性症状，恢复性症状，恢复CD4CD4细胞的数量，但并不能清除病毒。随着细胞的数量，但并不能清除病毒。随着CD4CD4细胞不断下降，

19、当降至细胞不断下降，当降至500/ul500/ul左右时，开始出现机会性左右时，开始出现机会性感染或其它疾病，进入症状期。当感染或其它疾病，进入症状期。当CD4CD4低于低于200/ul200/ul时，即进时，即进入艾滋病期。入艾滋病期。.36HAARTHAARTCD4+TCD4+T淋巴细胞介导的免疫淋巴细胞介导的免疫功能逐渐丧失功能逐渐丧失CTLCTL丧失必要的体内环境，丧失必要的体内环境，功能下降功能下降.37病毒变异和耐药性的测定 随着随着HAARTHAART治疗的广泛开展，病毒变异和耐药治疗的广泛开展，病毒变异和耐药株正在不断出现，甚至对一个药物的耐药可引株正在不断出现，甚至对一个药物

20、的耐药可引起多种药物的交叉耐药。起多种药物的交叉耐药。 因此近年来各国相继建立起病毒变异和耐药的因此近年来各国相继建立起病毒变异和耐药的测试方法，包括测试方法，包括基因型基因型HIVHIV耐药测试耐药测试和和表型表型HIVHIV耐药测试耐药测试。 .38表型HIV耐药性测试方法 能直接测出能直接测出HIV-1HIV-1对药物的敏感度，并能揭示事对药物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉的耐药情况，有利于指导先存在或交叉的耐药情况，有利于指导HIV-1HIV-1感感染者有效地用药。染者有效地用药。 目前市面上供应试剂盒已有目前市面上供应试剂盒已有2 2种，即种，即AVAV（Vicro Vicro A

21、ntivirogramAntivirogram）和和PSPS（Virologic PhenoSenseVirologic PhenoSense），两者方法均应用从生长于载体中的两者方法均应用从生长于载体中的HIV-1HIV-1而获得而获得的重组病毒和病人标本中蛋白酶与逆转录酶序列，的重组病毒和病人标本中蛋白酶与逆转录酶序列，分析与野病毒之间分析与野病毒之间IC50IC50值相差倍数，一般达值相差倍数，一般达551010倍以上为阳性。倍以上为阳性。 这种方法的最大优点是可以获得各种药物耐药量这种方法的最大优点是可以获得各种药物耐药量度数据，但不足的是试验慢又昂贵，技术要求高。度数据，但不足的是试

22、验慢又昂贵，技术要求高。 .39基因型HIV耐药性测试方法 当病毒对某些药物产生耐药性时，病毒基因会发生一些当病毒对某些药物产生耐药性时，病毒基因会发生一些明确的突变。病毒耐药基因型的检测有助于预测某些药明确的突变。病毒耐药基因型的检测有助于预测某些药物的治疗效果。物的治疗效果。 检查从病人血液标本中分离到的检查从病人血液标本中分离到的HIVHIV基因物质，应用核酸基因物质，应用核酸序列分析或杂交技术以确定病毒变异的位点，并可参考序列分析或杂交技术以确定病毒变异的位点，并可参考已有数据库按不同亚型进行比较。在确认变异后，与既已有数据库按不同亚型进行比较。在确认变异后，与既往耐药或交叉耐药研究比较，间接地估计药物耐药情况，往耐药或交叉耐药研究比较，间接地估计药物耐药情况， 优点简单快速，费用低。优点简单快速，费用低。 缺点是能确认所分离到的基因变异，但无法指出药物耐缺点是能确认所分离到的基因变异，但无法指出药物耐药的程度。药的程度。 此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！