FISH技术在血液疾病诊断中的应用ppt课件.pptx

1、荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH）技术）技术血液肿瘤诊疗中的应用血液肿瘤诊疗中的应用一、技术一、技术 二、质控二、质控 三、三、临床应用临床应用四、多技术结合应用案例四、多技术结合应用案例技术理论技术理论1950-19601960-19701970-19801980-1990显带时期显带时期非显带时期非显带时期18881888提出提出 染色染色 体体19141914染 色染 色体体 畸畸变 导变 导 致 肿致 肿瘤瘤19561956确定确定 染色染色 体体46 46 条条19581958应用应用 于血于血 液学液学19601960发现发现Ph Ph 染色体染色体 CMLCML显带技

2、显带技 术高速术高速 发展发展 G/RG/R多种血多种血 液病相液病相 关异常关异常 核型被核型被 发现发现FISHFISH中期中期/ /间期间期多色多色 FISHFISH微阵列技术微阵列技术 aCGHaCGH、aSNPaSNPCGHCGH技术技术分子遗传分子遗传细胞遗传学发展简史细胞遗传学发展简史FISHFISH技技术术的发展的发展1990年FISH1992年CGH1996年24色FISH（SKY、M-FISH、RX-FISH）2001年array CGH技术原理技术原理AGGCTATTCCGATACOVALENT BONDFFSpecimen DNAFISH Probe DNA操作步骤操作

3、步骤FISHFISH样本的制备样本的制备（染色体制备、细胞滴片制备）（染色体制备、细胞滴片制备）探针制备（体系：杂交缓冲液、蒸馏水、探针）探针制备（体系：杂交缓冲液、蒸馏水、探针）探针标记探针标记杂交（杂交（7676变性变性10min10min、3737杂交杂交10h10h）洗脱洗脱DAPIDAPI复染复染荧光显微镜检测荧光显微镜检测结果分析结果分析FISHFISH技技术术的特点的特点 操作简便，稳定，人员培训较快操作简便，稳定，人员培训较快 方法敏感，特异性好，检测效率高，能迅速得到方法敏感，特异性好，检测效率高，能迅速得到 结果，结果，2424小时就可以完成检测小时就可以完成检测 标本来源

4、丰富，细胞不需培养，间期细胞，分裂标本来源丰富，细胞不需培养，间期细胞，分裂 中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细 胞皆可以被检测胞皆可以被检测 可与多种技术结合（细胞形态学、免疫学、流式可与多种技术结合（细胞形态学、免疫学、流式 细胞术），可回顾性分析细胞术），可回顾性分析, ,可确定恶性细胞的克隆可确定恶性细胞的克隆 起源或鉴别良恶性细胞起源或鉴别良恶性细胞FISHFISH技技术术的局的局限限性性 异常检测取决于能否获得相应异常检测取决于能否获得相应探探针针 三体检测敏感性高于单体或缺失三体检测敏感性高于单体或缺失 骨髓、外周血标本较实体瘤、

5、骨髓、外周血标本较实体瘤、石石蜡切蜡切片片好好处处理理 不能检测全基因组异常（间不能检测全基因组异常（间期期FISHFISH）FISHFISH主要仪器主要仪器 FISHFISH分析工作站（荧光显微镜、分析照相分析工作站（荧光显微镜、分析照相软软件）件） 荧光原位杂交仪荧光原位杂交仪 恒温水浴槽恒温水浴槽 高速离心机高速离心机 培养箱培养箱 微量加样器微量加样器pHpH仪仪FISHFISH技术比较技术比较FISHFISHSKY M-SKY M-FISHFISHRX-FISHRX-FISHCGHCGHaCGHaCGH全染色体扫描全染色体扫描平衡易位平衡易位部分不平衡易位不平衡易位部分倒位倒位部分缺

6、失缺失部分扩增扩增部分非整倍体非整倍体分辨率分辨率1-10 kb2-10 Mb2-10 Mb3 Mb10-100kbFISHFISH探针种类探针种类着丝粒探针位点探针涂染探针双色单融合探针双色单融合探针额外信号探针额外信号探针双色双融合探针双色双融合探针正常异 常双色分离探针双色分离探针数量、位点探针数量、位点探针人类细胞遗传学命名人类细胞遗传学命名 nunuc c ish(CEP8ish(CEP82)4002)400nunuc c ish(BCR,ABL)ish(BCR,ABL)24024000nunuc c ish(BCR,ABL)ish(BCR,ABL)3,(B3,(BCRCR coco

7、n n A AB BL L2)380/4002)380/400nunuc c ish(MLLish(MLL2)4002)400 nunuc c ish(MLLish(MLL2)(52)(5MLMLL L sesep p 3 3MLMLL L1)100/2001)100/200 nunuc c ish(CEPXish(CEPX2)2/(2)2/(C CEPEPX X,CE,CEP PY)Y)1 1 3 39898 A: nuc ish(ABL,BCR)2B: nuc ish(ABL 2,BCR 3)ABLBCRAABLBCRBA: nuc ish(ABL,BCR)3(ABL con BCR2)

8、B: nuc ish(ABL,BCR)4 (ABL con BCR3)C: nuc ish(ABL 3,BCR 2) (ABL con BCR1)ABLBCRBBCRABLACABLBCRTELAML1A: nuc ish(TEL2,AML13)(TEL con AML11) B: nuc ish(TEL1,AML14)(TEL con AML11) C: nuc ish(TEL2,AML15)AML1TEL/AML1AAML1TELBCABCD5S721D5S721D5S721EGR1EGR1EGR1A: nuc ish(D5S23/D5S7211,EGR11) B: nuc ish(D5S

9、23/D5S7212,EGR11) C: nuc ish(D5S23/D5S7213,EGR11)质量控制质量控制质量管理内容质量管理内容 商品探针、自配试剂验证商品探针、自配试剂验证 标准化流程及规范化操作（前标准化流程及规范化操作（前处处理、理、实实验验操操作）作） 规范判读标准规范判读标准 建立本实验室判读阈值建立本实验室判读阈值 建立临床生物参考区间建立临床生物参考区间FISHFISH操作流程操作流程 样本制备：样本制备：细胞、骨髓、外周血、组织等 制片制片：细胞悬液滴片或石蜡组织切片 预处理预处理：2SSC，固定液，NaSCN 酶消化酶消化：胃蛋白酶，蛋白酶K 变性变性：温度 杂交杂

10、交：互补结合，温度 洗涤洗涤：无附离子溶液，PH，温度 复染复染：DAPI II 读片：读片：荧光显微镜，滤镜FISHFISH技术要点技术要点 样本浓度、切片厚度、细胞状态样本浓度、切片厚度、细胞状态 充分低渗与固定充分低渗与固定 制片环境温度与湿度制片环境温度与湿度 探针充分混匀探针充分混匀 变性液变性液pHpH与温度与温度 橡皮泥严密封片橡皮泥严密封片 洗脱液温度洗脱液温度 抗衰变剂抗衰变剂规范判读规范判读 规范正常和异常信号规范正常和异常信号 杂交成功杂交成功率率75% 计数数量、方法：计数数量、方法：单人，分别于不同区域各连续单人，分别于不同区域各连续计计数数200个细胞个细胞双人，每

11、人于不同区域各计双人，每人于不同区域各计数数200个个细细胞胞计数规范计数规范信号判读误差信号判读误差分离信号误判分离信号误判石蜡切片误差石蜡切片误差建立阈值建立阈值 选取正常样本选取正常样本10-2010-20份建立针对探针的假阳性率份建立针对探针的假阳性率 统计方法统计方法 x+3SD 分布（分布（95%95%可信区间）可信区间） 结合临床逐步建立生物参考区间结合临床逐步建立生物参考区间结果及报告结果及报告临床应用临床应用FISHFISH临床应用临床应用检测染色体数目与结构异常检测染色体数目与结构异常疗效分析疗效分析鉴定标记染色体鉴定标记染色体检测早期复发检测早期复发鉴定移植后早期复发鉴定

12、移植后早期复发鉴定肿瘤细胞的细胞系列鉴定肿瘤细胞的细胞系列基因定位、病灶组织定位基因定位、病灶组织定位FISHFISH常常用用探针探针的的组合组合应应用用探针种类探针种类检测目的检测目的慢性粒细胞白血病（慢性粒细胞白血病（CMLCML）：）：BCR/ABL (BCR/ABL (融合探针融合探针) ) BCR/ABL/ASS1BCR/ABL/ASS1t(9;22)t(9;22)伴ASS1基因缺失探针种类探针种类检测目的检测目的急性髓系白血病（急性髓系白血病（AMLAML）：）：PML/RARa (PML/RARa (融合探针融合探针) ) RARaRARat(15;17)AML1/ETO (AM

13、L1/ETO (融合探针融合探针) )t(8;21)MLLMLL（11q2311q23）( (分离探针分离探针) )t(v;11)CBFBCBFB（16q2216q22）( (分离探针分离探针) )inv(16)；t(16;16)EVI1(3q26) (EVI1(3q26) (分离探针分离探针) )t(3;3);inv(3)探针种类探针种类检测目的检测目的急性淋系白血病（急性淋系白血病（A AL LL L）：）：BCR/ABBCR/ABL L ( (融合探融合探针针) )t(9;22)TEL/AMLTEL/AML1 1 ( (融合探融合探针针) )t(12;21)TCF3/PBTCF3/PBX

14、 X1 1 ( (融合探融合探针针) )t(1;19)MLLMLL（11q211q23 3）( (分离分离探探针针) )t(v;11)IGHIGH（14q314q32 2）( (分离分离探探针针) )t(v;14)探针种类探针种类检测目的检测目的骨髓增生异常综合征骨髓增生异常综合征（M MD DS S）：）：CEPCEP8 8 ( (位点探针位点探针) )+8EGR1/D5EGR1/D5S S7 72121（5 5q q3 31 1; ;5 5p p1 15 5. .2 2）( (双位点探针双位点探针) )-5；del(5q31)D7S486/D7S486/C CE EP7P7（7 7q q3

15、 31 1; ;7 7p p1 11 1- -7 7q q1 11 1）( (双位点探针双位点探针) )-7；del(7q31)D20S108D20S108（2 20 0q q1 12 2）( (位位点探点探针针) )del(20q12)EVI1(3qEVI1(3q2 26 6) ) ( (分离探针分离探针) )t(3;3);inv(3)探针种类探针种类检测目的检测目的淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病：病：RB-1RB-1（或（或D1D13 3S S3 31 19 9) )（1 13 3q q1 14 4）( (位位点点探探针针) ) del(13)(q14)IGHIGH（1

16、4q314q32 2）( (分离分离探探针针) )涉及IGH基因异常初筛P53P53（17p117p13 3. .1 1）( (位位点点探探针针) )P53基因缺失CCND1/ICCND1/IG GH H ( (融合探针融合探针) )CCNCCND1D1t(11;14)MYCMYC（8q248q24）( (分分离离探探针针) )I IG GH H/ /C C- -M MYCYC涉及MYC基因异常初筛ATMATM（11q211q22 2. .3 3）( (位位点点探探针针) )ATM基因缺失CEP1CEP12 2 ( (位点探针位点探针) )+12BCL6BCL6（3q23q27 7）( (分离

17、分离探探针针) )涉及BCL6基因异常初筛BCL2BCL2（18q18q2 21 1）( (分分离探离探针针) )I IG GH H/ /B BC CL L2 2涉及BCL2基因异常初筛探针种类探针种类检测目的检测目的多发性骨髓瘤（多发性骨髓瘤（MMMM）：（建议应用）：（建议应用CD138CD138分选细胞）分选细胞）RB-1RB-1（13q1413q14）( (位点探针位点探针) )RB-1基因缺失初筛检测初筛检测IGHIGH（14q3214q32）( (分离探针分离探针) )涉及IGH基因异常初筛P53P53（17p13.117p13.1）( (位点探针位点探针) )P53基因缺失CKS

18、1B/CDKN2CCKS1B/CDKN2C（1q21;1p32.31q21;1p32.3）( (双位点探针双位点探针) )1q21扩增;del(1p32)FGFR3/IGH (FGFR3/IGH (融合探针融合探针) )t(4;14)IGHIGH阳性标阳性标 本后续检测本后续检测MAF/IGH (MAF/IGH (融合探针融合探针) )t(14;16)CCND1/IGH (CCND1/IGH (融合探针融合探针) )t(11;14)MAFB/IGH (MAFB/IGH (融合探针融合探针) )t(14;20)探针种类探针种类检测目的检测目的伴嗜酸细胞增多的髓系或淋系肿瘤、伴嗜酸细胞增多的髓系或淋系肿瘤、MDSMDS、MPNMPNFGFR1/D8Z2(8p11) (FGFR1/D8Z2(8p11) (分离探针分离探针) )PDGFRAPDGFRA（4q124q12）PDGFRBPDGFRB（5q32-q335q32-q33）t(8;13) 4q12 t(5;12)移植排斥检测：移植排斥检测：CEPX/Y (CEPX/Y (双位点探针双位点探针) )XX和XY结语结语精准方法，细致分析精准方法，细致分析新技术及多学科技术联合新技术及多学科技术联合探讨特征性染色体异常分子机制探讨特征性染色体异常分子机制疗效判断预后评估，指导靶向和个体化治疗疗效判断预后评估，指导靶向和个体化治疗