急性毒性试验演示课件.ppt

1、2022-7-51实验动物与动物实验实验动物与动物实验第第1 1讲讲 急性急性毒性毒性试验试验 1. Acute toxicity test 2022-7-52一、基本概念一、基本概念n急性毒性急性毒性：指指24h24h内内单次或多次单次或多次大剂量大剂量给予某药物所出给予某药物所出现的现的有害作用有害作用，亦即快速而剧烈的中毒反应。亦即快速而剧烈的中毒反应。n急性毒性急性毒性试验：以试验：以观察急性毒性观察急性毒性为目的而设计的一种毒为目的而设计的一种毒理学试验，急性毒性试验以理学试验，急性毒性试验以阐明药物的剂量阐明药物的剂量- -毒效关系毒效关系为出发点，为为出发点，为全面毒性试验全面毒

2、性试验打下基础打下基础。2022-7-53n内容内容p定性定性毒性反应出现和消失时间、可能的靶器毒性反应出现和消失时间、可能的靶器官和死亡原因等；官和死亡原因等；p定量定量致死量、最大给药量、半数致死量等。致死量、最大给药量、半数致死量等。n目的和意义目的和意义p测定测定LDLD5050及相关参数，初步估计毒性大小；及相关参数，初步估计毒性大小；p观察急性中毒症状，推测毒性靶器官；观察急性中毒症状，推测毒性靶器官；p为长期毒性试验和特殊毒性试验的剂量设计提供参考；为长期毒性试验和特殊毒性试验的剂量设计提供参考；p为早期判断研发价值提供资料。为早期判断研发价值提供资料。二二、急性毒性急性毒性试验

3、的内容、目的和意义试验的内容、目的和意义2022-7-54三三、 LDLD5050的测定及统计学原理的测定及统计学原理oLDLD5050的的概念概念 1 1）能引起能引起一群一群实验动物实验动物50%50%死亡死亡所需的剂量所需的剂量， 2 2）是某药物预期引起是某药物预期引起50%50%死亡的统计学剂量死亡的统计学剂量。 是一个有是一个有置信限估计的中介值置信限估计的中介值， 是反映药物毒效应的上限指标是反映药物毒效应的上限指标， 是药物急性毒性分级依据。是药物急性毒性分级依据。2022-7-55oLDLD5050 值的作用及意义值的作用及意义nLDLD50 50 是药物的特征性参数之一是药

4、物的特征性参数之一，用来判断毒性程度。用来判断毒性程度。n有助于计算有助于计算毒性参数。毒性参数。 急性毒作用带（急性毒作用带（ZacZac）；）； 治疗指数治疗指数 TITI（LDLD5050/ED/ED5050）；）； 安全指数安全指数 SISI（LDLD5 5/ED/ED5 5）；）； 可靠安全系数可靠安全系数 CSFCSF（LDLD1 1/ED/ED9999）。）。ZacZac= =LDLD5050LimLimacac以以LDLD5050与急性毒性最小有作用剂量与急性毒性最小有作用剂量( (阈阈剂量剂量， LimLimacac) )的比值来的比值来表示表示（是药物毒性上限指标与下限指标

5、的比值）（是药物毒性上限指标与下限指标的比值）。(1) (1) 急性毒作用带急性毒作用带（ZacZac） ZacZac大小反应了急性大小反应了急性毒性毒性阈阈剂量与剂量与 LDLD5050的距离的距离，越大越大，说明药物引起死亡说明药物引起死亡的危险性越小的危险性越小；越越小，则小，则引起死亡的危险性越引起死亡的危险性越大大 。 TI=半数致死量半数致死量（LD50）半数有效量半数有效量（ED50） TITI是指半数致死量与半数有效量之比值。是指半数致死量与半数有效量之比值。（2 2）治疗指数治疗指数（Therapeutic index,TITherapeutic index,TI） TI T

6、I 值越大值越大 , , 越安全越安全 , , 一般认为一般认为 TI TI 大于大于3 3 的药物才的药物才可能具有实用意义。可能具有实用意义。 目目前用于临床的药物前用于临床的药物 , , 其其 TI TI 值大多大于值大多大于1010。SI=LD5ED95SI SI 是指是指基本无害基本无害量与量与基本有效基本有效量之比值。量之比值。（3 3）安全）安全指数指数（Safety indexSafety index，SISI） SI SI 值值可以说明药物的临床安全性，但该值往往难以精可以说明药物的临床安全性，但该值往往难以精确计算出来，测定误差很大。确计算出来，测定误差很大。2022-7-

7、59CSF=LD1ED99CSFCSF是指是指肯定无害肯定无害量与量与肯定有效肯定有效量之比值。量之比值。（4 4）可靠安全系）可靠安全系数数（Certain safety factorCertain safety factor，CSFCSF） CSF CSF 值值可以说明药物的临床安全性，可以说明药物的临床安全性，CSFCSF越大，越安全。越大，越安全。毒性毒性分级分级大鼠大鼠一次一次经口经口LD50(mgkg体重体重-1)6只只大鼠吸入大鼠吸入4小时小时,死死亡亡2-4只的浓度只的浓度(ppm)兔经皮兔经皮LD50(mgkg体重体重-1)对人可能致死的估计量对人可能致死的估计量gkg体重体

8、重-1 g60kg体重体重-1剧毒剧毒11050.050.1高毒高毒11050.053中等毒中等毒50100440.530低毒低毒50010003505250微毒微毒5000100002180151000 小鼠小鼠LD50（mg/kg体重）体重） 口服口服 皮下注射皮下注射 静脉或腹腔注射静脉或腹腔注射毒药毒药 30 20 10剧药剧药 300 200 100普通药普通药 300 200 100药物急性毒性分级药物急性毒性分级2022-7-511oLDLD5050 绝非判断药物急性毒性的惟一指标绝非判断药物急性毒性的惟一指标o仅是一个统计学术语仅是一个统计学术语o是许多反映药物急性毒性的参数之

9、一是许多反映药物急性毒性的参数之一。急性毒性作用急性毒性作用具有比具有比 LDLD5050更为深刻的内涵更为深刻的内涵，剂量剂量- -效应效应（死亡死亡）曲线的斜率曲线的斜率比比 LDLD5050 更有价值甚至更为关键。更有价值甚至更为关键。LD50 及相关参数的及相关参数的缺陷缺陷2022-7-512n动物消耗量大动物消耗量大, ,获得的信息有限获得的信息有限；n影响影响LDLD5050值的因素较多值的因素较多，比如动物的种类、品系、年龄、比如动物的种类、品系、年龄、性别、健康状况等性别、健康状况等；n从安全性评价角度来讲从安全性评价角度来讲，需要的不是精确的需要的不是精确的LDLD5050

10、值值，而而是更多的毒性信息是更多的毒性信息。LD50 测定测定的的明显不足明显不足2022-7-513四四、非、非致致死性毒性反应及死性毒性反应及其其转归转归 非致死性（毒性）反应：非致死性（毒性）反应：试验中有些动物幸免于致死，但存试验中有些动物幸免于致死，但存在不可逆的损伤。在不可逆的损伤。非致死性有害反应与致死性反应仅仅是程度上的差异，都非致死性有害反应与致死性反应仅仅是程度上的差异，都是用药过程中不希望出现的。是用药过程中不希望出现的。非致死性非致死性毒性毒性反应的转归反应的转归是否可逆是否可逆反应是否可逆主要取决于反应是否可逆主要取决于: : 毒性作用涉及的器官与系统毒性作用涉及的器

11、官与系统 药物的内在毒性药物的内在毒性 用药时间的长短用药时间的长短 在确定的时间范围内在确定的时间范围内，药物在体内的量药物在体内的量 动物的年龄和健康状况动物的年龄和健康状况如在动物中观察到不可逆反应，则应注意外推至人时是否存在。如在动物中观察到不可逆反应，则应注意外推至人时是否存在。2022-7-515一、基本要求一、基本要求n两种动物两种动物p小动物小动物 LD LD5050、最大耐受量试验、最大耐受量试验p大动物大动物 单次给药的近似致死量和最大耐受量单次给药的近似致死量和最大耐受量n两种给药途径两种给药途径 其中一种必须与临床用药途径相同其中一种必须与临床用药途径相同n试验周期试验

12、周期 7-14 7-14天天nLDLD5050计算方法计算方法 Bliss Bliss法法n必要时可增加一个溶媒对照组必要时可增加一个溶媒对照组n实验条件及方法必须规范化实验条件及方法必须规范化FDA日本日本美国美国英国英国前西德前西德欧盟欧盟俄罗斯俄罗斯WHO瑞士瑞士动物动物种类种类3-4 2 3 2 2 2 2 3 2给药给药途径途径 1 3 3 2 2 2 2 3 22022-7-517二二、实验动物实验动物 n动物选择的原则：动物选择的原则： 尽量选择急性毒性反应与人近似的动物；尽量选择急性毒性反应与人近似的动物； 易于饲养管理、试验操作方便的动物；易于饲养管理、试验操作方便的动物；

13、繁殖生育力较强，数量较大能够保障供应；繁殖生育力较强，数量较大能够保障供应； 价格较低，易于获得的动物。价格较低，易于获得的动物。2022-7-518二二、实验动物实验动物 n在在基础性研究工作基础性研究工作中按科研课题的具体要求选择，在中按科研课题的具体要求选择，在法法规性毒理学评价工作规性毒理学评价工作中，必须按照其规范要求进行。中，必须按照其规范要求进行。n无论使用何种动物都必须无论使用何种动物都必须注明动物注明动物的来源、品系、年龄、的来源、品系、年龄、体重、性别、饲养条件以及动物生产合格证书。如系无体重、性别、饲养条件以及动物生产合格证书。如系无特殊病原体动物也应在报告中注明。特殊病

14、原体动物也应在报告中注明。2022-7-519二二、实验动物实验动物 n种类种类n小鼠小鼠、大鼠、犬、猴、家兔（经口给药不用）、大鼠、犬、猴、家兔（经口给药不用）n下列情况考虑选用非啮齿类动物下列情况考虑选用非啮齿类动物p大鼠、小鼠大鼠、小鼠LDLD5050差别明显；差别明显；p药物药动学在啮齿类与非啮齿类之间存在明显差异；药物药动学在啮齿类与非啮齿类之间存在明显差异；p为了得到明确的毒效表现，初步了解药物的特性后，为了得到明确的毒效表现，初步了解药物的特性后，在条件许可的情况下可考虑选用其他敏感动物。在条件许可的情况下可考虑选用其他敏感动物。2022-7-520二二、实验动物实验动物 n健康

15、状况：健康动物健康状况：健康动物n体重与年龄体重与年龄同一批实验中同一批实验中，动物的年龄、体重应尽可能一致动物的年龄、体重应尽可能一致；原则上选用原则上选用年轻成年年轻成年动物动物，啮，啮齿类动物的年龄一般为齿类动物的年龄一般为7 7 9 9 周龄周龄，非非啮啮齿类动物起始为齿类动物起始为 6 6 8 8 月龄月龄；同一批试验中同一批试验中，动物的初始体重变异要求不超过平均体重的动物的初始体重变异要求不超过平均体重的20%20%。(同一组最大组与最小组差异不得超过20%、组间变异不应超过10%）动物动物生活年生活年成年成年体重选择范围（体重选择范围（g）种类种类限限（年年）时间时间(月月)体

16、重体重(g)急性实验急性实验长期性实验长期性实验小鼠小鼠1.5221518251518大鼠大鼠22.5315015024050100豚鼠豚鼠682250200250150200家兔家兔493415001500200012001500狗狗102034-800015000400060002022-7-522二二、实验动物实验动物 n性别性别急性毒性急性毒性试验中应考虑雌雄动物试验中应考虑雌雄动物数目相等数目相等；但在试验中如发现某性别动物的死亡率明显高于另一性别时，则最但在试验中如发现某性别动物的死亡率明显高于另一性别时，则最好对该性别的好对该性别的 LDLD5050 另外计算，或考虑选用另外计算

17、，或考虑选用敏感性别敏感性别的动物重新进的动物重新进行急性毒性试验。行急性毒性试验。2022-7-523二二、实验动物实验动物 n动物分组方法动物分组方法动物应随机分配至各剂量组动物应随机分配至各剂量组；随机分组可使动物形成一个均匀的整体，并可减少因个体随机分组可使动物形成一个均匀的整体，并可减少因个体差异而造成的误差差异而造成的误差;体重或健康状况不符合要求的动物应在随机分组前剔除。体重或健康状况不符合要求的动物应在随机分组前剔除。随机分组 按体重分区组：18g、1820g、20 22g 、2224g、2426g、26g.再将这7组分入各组中。2022-7-524二二、实验动物实验动物 n动

18、物动物给药前禁食处理给药前禁食处理p经口途径染毒，在试验前应作禁食处理。经口途径染毒，在试验前应作禁食处理。 大鼠主要在夜间进食，要求染毒前应大鼠主要在夜间进食，要求染毒前应隔夜禁食隔夜禁食。小。小鼠由于其消化吸收和代谢速度较快，可隔夜禁食也可禁鼠由于其消化吸收和代谢速度较快，可隔夜禁食也可禁食食4 4小时以上。大动物常前一天正常给食，染毒前不喂小时以上。大动物常前一天正常给食，染毒前不喂食即可。食即可。p禁食期间均正常给水。禁食期间均正常给水。p染毒染毒2 2小时后提供饲料。小时后提供饲料。p经口多次染毒，可不禁食。经口多次染毒，可不禁食。2022-7-525三、剂量三、剂量水平水平的选择的

19、选择n剂量水平的选择以测定剂量水平的选择以测定LDLD5050及剂量及剂量- -反应曲线的斜率为目反应曲线的斜率为目的（的（10% - 10% - 50%50% - 90% - 90%）；）；n4 4上以上剂量，至少有上以上剂量，至少有3 3个落在个落在10% - 90%10% - 90%之间；之间；n做预试验来摸索剂量做预试验来摸索剂量n通过文献检索，为已知化学类别的药物确定预期毒性中值；通过文献检索，为已知化学类别的药物确定预期毒性中值；n对全新结构的药物或中草药复方，可先通过小批量动物摸索，找对全新结构的药物或中草药复方，可先通过小批量动物摸索，找出出D Dminmin和和D Dmaxm

20、ax。2022-7-526 已知结构的药物已知结构的药物确定预期毒性中值确定预期毒性中值 对于己了解化学结构的药物，在确定其所属化学类别及对于己了解化学结构的药物，在确定其所属化学类别及其所含的特殊基团的基础上，查阅有关文献，其所含的特殊基团的基础上，查阅有关文献，找出与药物结找出与药物结构近似或有共性基团的药物的毒性资料构近似或有共性基团的药物的毒性资料；其次最好能；其次最好能了解药了解药物的理化性质物的理化性质，最后综合考虑这两方面的资料，选择与药物，最后综合考虑这两方面的资料，选择与药物的化学结构和理化性质最为接近的的化学结构和理化性质最为接近的己知药物的己知药物的 LDLD5050 作

21、为药作为药物的预期毒性中值。物的预期毒性中值。理论依据：构效关系理论依据：构效关系2022-7-527 确定预期毒性中值（确定预期毒性中值（LDLD5050）后，以此值为）后，以此值为中间剂量中间剂量，再以该中间剂，再以该中间剂量值为基准，按一定的组间距量值为基准，按一定的组间距上下各推二个剂量上下各推二个剂量，作为预试验的剂量，作为预试验的剂量分组。分组。 预试时，组间距可稍大些，预试时，组间距可稍大些，i i 值可取值可取 0.60.6，相邻剂量比为，相邻剂量比为 1:41:4。如果估计药物的致死剂量范围较窄，组间距可适当缩小，如果估计药物的致死剂量范围较窄，组间距可适当缩小，i i 值取

22、值取 0.20.2，相邻剂量比为相邻剂量比为 1:1.61:1.6。组间距组间距i i 值，剂量的对数值等差分布，剂量等比分布值，剂量的对数值等差分布，剂量等比分布 已知结构的药物已知结构的药物确定预期毒性中值确定预期毒性中值通过预试找出药物使通过预试找出药物使 1010% %-90% -90% 实验动物死亡剂量的大致范围实验动物死亡剂量的大致范围, , 再据此再据此确定正式试验的具体分确定正式试验的具体分组组方案方案 , , 此时可按下式求算组间距此时可按下式求算组间距（i i 值值 ）。或或 i =log LD90 - log LD10n - 1 i =log LD100 - log LD

23、0n - 1 已知结构的药物已知结构的药物确定预期毒性中值确定预期毒性中值2022-7-529 全新结构药物或中草药复方全新结构药物或中草药复方确定极值确定极值 先通过小批量动物的摸索先通过小批量动物的摸索，找出找出 0 0 % % 及及100100% %估计致死量估计致死量 ( (即即Dmin Dmin 和和 Dmax)Dmax)，再求出再求出 i i 值值。 (1) (1) 用用 10 10 倍稀释的药物浓度系列倍稀释的药物浓度系列，用少量动物用少量动物（每组每组 2 2-3 -3 只只），），找出大致死亡范围。找出大致死亡范围。 剂量剂量 死亡数死亡数/ /动物数动物数 5mg/kg 5

24、mg/kg 0/2 0/2 50mg/kg 50mg/kg 1/21/2 500mg/kg 500mg/kg 2/22/2 5000mg/kg 2/2 5000mg/kg 2/2上述结果提示上述结果提示 , , 大致死亡范围为大致死亡范围为 50mg/kg-500mg/kg50mg/kg-500mg/kg。(2) (2) 再用再用 1 1、2 2、4 4、88等等 2 2 倍稀释的药物倍稀释的药物浓度每组浓度每组 4 4 只动物只动物实验，找出实验，找出DminDmin和和DmaxDmax。 全新结构药物或中草药复方全新结构药物或中草药复方确定极值确定极值 当出现当出现4/44/4死亡时，如其

25、前一组为死亡时，如其前一组为3/43/4死死亡，则取亡，则取4/44/4组的剂量为组的剂量为DmaxDmax，如前一组为，如前一组为2/42/4或或1/41/4死亡死亡( (如本例为如本例为2/4)2/4)，考虑到，考虑到4/44/4组组的剂量在正式实验中可能的死亡率低于的剂量在正式实验中可能的死亡率低于70%70%，为慎重起见，可将为慎重起见，可将4/44/4组的剂量乘以组的剂量乘以2 2作为作为D Dmaxmax； 当出现当出现0/4 0/4 死亡时，如其后一组的死亡死亡时，如其后一组的死亡率为率为1/41/4，则取，则取0/40/4组的剂量为组的剂量为 DminDmin，如后一，如后一组

26、死亡率大于组死亡率大于1/41/4，考虑到，考虑到0/40/4组的剂量在正组的剂量在正式实验中可能的死亡率高于式实验中可能的死亡率高于70%70%，则将，则将0/40/4组组的剂量除以的剂量除以2 2，作为，作为D Dminmin。 剂量剂量 死亡数死亡数/动物数动物数 50mg/kg 0/4 * 100mg/kg 2/4 200mg/kg 2/4 400mg/kg 4/4 * 800mg/kg 4/4Dmin =50Dmin =5070%70%235235（mg/kgmg/kg）DmaxDmax = = 40040070%70%2 2 = = 560560（mg/kgmg/kg）THANK

27、YOUSUCCESS2022-7-5可编辑 剂量剂量 死亡数死亡数/动物数动物数 50mg/kg 0/4 * 100mg/kg 2/4 200mg/kg 2/4 400mg/kg 4/4 * 800mg/kg 4/4DmaxDmax：当出现当出现 4/4 4/4 死亡时死亡时, ,如前一组死亡率为如前一组死亡率为2/42/4时时Dmax=4/4Dmax=4/4死亡剂量死亡剂量1.4( )=4001.4( )=4001.4=5601.4=560（mg/kgmg/kg）DminDmin：当出现当出现 0/4 0/4 死亡时，如后一组死亡率大于死亡时，如后一组死亡率大于1/41/4Dmin =0/4

28、Dmin =0/4死亡剂量死亡剂量1.4( )=501.4( )=501.4351.435（mg/kgmg/kg）22陈奇：陈奇：中药药理研究方法学中药药理研究方法学第第3版版在确定了在确定了 DmaxDmax和和DminDmin以后以后，可，可求得组间距求得组间距（i i 值值 ):):以以 Dmin Dmin 的对数为起点的对数为起点，向上推出向上推出 n n 组动物的各组剂量的对数组动物的各组剂量的对数值值，求出反对数即可求得各组的剂量。求出反对数即可求得各组的剂量。 i =log Dmax - log Dminn - 1求组间距求组间距（i 值值 ):2022-7-534四、剂量组数及

29、动物数四、剂量组数及动物数LDLD5050 测定中剂量组数的设计测定中剂量组数的设计，除符合统计学要求外除符合统计学要求外，还应还应根据预试验所提供的药物的毒性情况而定根据预试验所提供的药物的毒性情况而定；一般而言一般而言，在实际工作中设在实际工作中设 4 45 5 个剂量组个剂量组，剂距以剂距以 0.650.650.85 0.85 为宜为宜；小鼠每组小鼠每组 10 10 只只 ( ( 雌雄各半雌雄各半 ) )，大鼠不应少于大鼠不应少于 6 68 8 只。只。2022-7-535五、剂型与给药五、剂型与给药n应写明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。应写明受试药物的名称、批号

30、、来源、纯度、保存条件及配制方法。n供试药品应能溶于或混悬于适当的溶媒，如果溶媒的毒性情况是未供试药品应能溶于或混悬于适当的溶媒，如果溶媒的毒性情况是未知的，则应设立一个溶媒对照组，溶媒对照组的给药容量应与最高知的，则应设立一个溶媒对照组，溶媒对照组的给药容量应与最高剂量组相等。对所用溶媒及助溶剂须有详细记录，以备分析和审核。剂量组相等。对所用溶媒及助溶剂须有详细记录，以备分析和审核。n给药途径要用给药途径要用2 2种，其中应包括推荐临床研究的给药途径。溶于水种，其中应包括推荐临床研究的给药途径。溶于水的药物应当测定静脉给药途径的急性毒性，口服药物应灌胃给药。的药物应当测定静脉给药途径的急性毒

31、性，口服药物应灌胃给药。n药物可以药物可以等体积等体积（各剂量组的药物浓度不同）或（各剂量组的药物浓度不同）或等浓度等浓度（各剂量组（各剂量组的给药体积不同）给药，但必须注意上述两种方式给药所观察到的的给药体积不同）给药，但必须注意上述两种方式给药所观察到的毒性效应可能是不尽相同的。毒性效应可能是不尽相同的。2022-7-536五、剂型与给药五、剂型与给药n给药的体积，啮齿类动物口服给药的最大的体积，对给药的体积，啮齿类动物口服给药的最大的体积，对非水溶液非水溶液而言而言以不超过以不超过10ml/kg10ml/kg为宜，为宜，水溶液或混悬液水溶液或混悬液一般不超过一般不超过20ml/kg20m

32、l/kg。如果。如果剂量较大而不便于一次给药，可以分成相等的容量，每隔剂量较大而不便于一次给药，可以分成相等的容量，每隔6 68 8小时小时给药，但必须在第一次给药后的给药，但必须在第一次给药后的2424小时内完成。小时内完成。n口服给药应禁食；静注给药应注意药液的口服给药应禁食；静注给药应注意药液的pHpH值、温度、渗透压、注值、温度、渗透压、注射速度射速度等可能影响毒效应的各种因素。等可能影响毒效应的各种因素。动物动物给药途径给药途径常用容量常用容量最大容量最大容量小鼠小鼠igig0.2ml/20g0.2ml/20g1.0ml/20g1.0ml/20giviv0.2ml/20g0.2ml/

33、20g0.5ml/20g0.5ml/20gipip0.2ml/20g0.2ml/20g1.0ml/20g1.0ml/20gs sc c0.1ml/20g0.1ml/20g0.5ml/20g0.5ml/20gimim0.1ml/20g0.1ml/20g0.2ml/20g0.2ml/20g表表1-6 1-6 急性毒性试验常用动物单次给药的常用容量和最大容量急性毒性试验常用动物单次给药的常用容量和最大容量大鼠大鼠igig 1.0ml/200g1.0ml/200g 3.0ml/200g3.0ml/200giviv 0.5ml/200g0.5ml/200g 1.0ml/200g1.0ml/200gipi

34、p 1.0ml/200g1.0ml/200g 3.0ml/200g3.0ml/200gs sc c 0.5ml/200g0.5ml/200g 1.0ml/200g1.0ml/200g狗狗imim 0.2ml/200g0.2ml/200g 0.5ml/200g0.5ml/200gigig 10ml/10ml/只只 2020ml/ml/只只iviv 3535ml/ml/只只 5050ml/ml/只只2022-7-538六、试验时限与量限六、试验时限与量限 急性毒性试验的急性毒性试验的观察时间观察时间取决于症状出现的时间、毒性强弱、致死速度、取决于症状出现的时间、毒性强弱、致死速度、恢复速率以及药物

35、本身的代谢特征等。恢复速率以及药物本身的代谢特征等。我国新药审批办法规定：急性毒性试验必须我国新药审批办法规定：急性毒性试验必须观察观察7 71414 d d，但一般不必超，但一般不必超过过2wk2wk（14 14 d d）。在表示药物的）。在表示药物的LDLD5050 时最好同时注明观察时间，这时最好同时注明观察时间，这样在毒性比较时，才会有共同的基础。样在毒性比较时，才会有共同的基础。 在实际工作中在实际工作中，对于毒性低的药物可用最大给药浓度和最大给药容量对于毒性低的药物可用最大给药浓度和最大给药容量单次或单次或24 h24 h内分次给药内分次给药，一般使用一般使用2020只只啮啮齿类动

36、物齿类动物，连续观察连续观察7 714 d14 d，如无死亡出现如无死亡出现，则该剂量即为药物的则该剂量即为药物的最大耐受剂量最大耐受剂量。等容注射量D C母药液配制的具体步骤：等比稀释溶液：各小鼠给药容积一样=0.1ml/10g预试中Dm=344mg/kg， Dn=141mg/kg，算出r=1.25，小鼠的平均体重为20g，每组10只，用药量为0.1ml/10g=10ml/kgC1=344mg/kg / 10ml/kg=34.4mg/ml每组药液量=每组动物总重用药量=200g0.1ml/10g=2ml1号2号3号4号5号1号液2号液3号液4号液5号液2ml2ml2ml2ml2ml2ml2m

37、l2ml2ml2022-7-540七七、观察指标、观察指标目的：目的：找出毒性作用的特征找出毒性作用的特征，初步获得药物毒效应的靶器官和受试动初步获得药物毒效应的靶器官和受试动物的死亡原因。物的死亡原因。内容：内容：v 笼边观察笼边观察 特别要注意给药后特别要注意给药后h h内内动物中毒症状及死亡情况。动物中毒症状及死亡情况。观察的时间间观察的时间间隔及频度必须根据症状出现、恢复、变化及死亡时间而定隔及频度必须根据症状出现、恢复、变化及死亡时间而定，一般给药一般给药后持续观察后持续观察 30min30min，第第1 1 4 4h h再观察再观察1 1次次，以后每天以后每天观察观察1 1次。次。

38、2022-7-541中毒部位中毒部位毒性症状表现毒性症状表现中枢神经及运中枢神经及运动神经系统动神经系统自发活动减少或增加，嗜睡，翻正反射消失，舔毛，噪动，自发活动减少或增加，嗜睡，翻正反射消失，舔毛，噪动，僵持，震颤，惊厥，共济失调，异常运动等僵持，震颤，惊厥，共济失调，异常运动等植物神经系统植物神经系统瞳孔放大或缩小，腺体分泌增加，流涎，竖毛，共济失调，瞳孔放大或缩小，腺体分泌增加，流涎，竖毛，共济失调，肌张力增强或减弱肌张力增强或减弱呼吸系统呼吸系统鼻孔分泌物，呼吸急促，呼吸缓慢，腹式呼吸，喘息，窒鼻孔分泌物，呼吸急促，呼吸缓慢，腹式呼吸，喘息，窒息，紫绀等息，紫绀等心血管系统心血管系统

39、心动过速，心动过缓，血管扩张或收缩，心输出改变，心心动过速，心动过缓，血管扩张或收缩，心输出改变，心律失常等律失常等胃肠道系统胃肠道系统粪便坚硬，干燥，量少，便秘，腹泻，水样便，呕吐，恶粪便坚硬，干燥，量少，便秘，腹泻，水样便，呕吐，恶心，干呕等心，干呕等泌尿系统泌尿系统血尿，多尿等血尿，多尿等眼睛眼睛流泪，眼球突出，上睑下垂，血性泪液，眨眼（瞬膜反流泪，眼球突出，上睑下垂，血性泪液，眨眼（瞬膜反射），角膜浑浊，虹膜炎，结膜炎等射），角膜浑浊，虹膜炎，结膜炎等皮肤、被毛皮肤、被毛水肿，发红，皮疹，炎症，被毛竖立，色黄等水肿，发红，皮疹，炎症，被毛竖立，色黄等表表1-7 1-7 急性毒性试验中的

40、一般毒性症状观察急性毒性试验中的一般毒性症状观察 2022-7-542七七、观察指标、观察指标v死亡过程与死亡时间死亡过程与死亡时间 药物的毒效应是不同的，毒性作用（反应）出现的先药物的毒效应是不同的，毒性作用（反应）出现的先后次序以及是否出现都可体现毒效应的差异。后次序以及是否出现都可体现毒效应的差异。 致死所需的时间和所需的剂量都是衡量药物毒性强弱致死所需的时间和所需的剂量都是衡量药物毒性强弱的依据。的依据。 死亡时间也可间接地反映药物毒作用性质的信息。死亡时间也可间接地反映药物毒作用性质的信息。2022-7-543七七、观察指标、观察指标v体重体重 给药前、给药期间给药前、给药期间（每天

41、或根据需要确定间隔每天或根据需要确定间隔）、动物死亡时及、动物死亡时及实验终止时必须对每个动物进行称重实验终止时必须对每个动物进行称重，观察药物对动物体重的影响。观察药物对动物体重的影响。 引起体重减轻或增长率减慢的原因较为复杂因此引起体重减轻或增长率减慢的原因较为复杂因此，体重的变化要体重的变化要在全面观察的基础上仔细地加以分析在全面观察的基础上仔细地加以分析。2022-7-544七七、观察指标、观察指标v 尸体解剖及病理组织学检查尸体解剖及病理组织学检查 对于对于濒死濒死的或的或己死亡己死亡的动物以及实验的动物以及实验终止时尚存活终止时尚存活的动物必须的动物必须进行系统进行系统的的尸体解剖

42、检查。尸体解剖检查。 病理组织学检查病理组织学检查并并非非必要的必要的检查项目检查项目。但是对于迟发死亡动物但是对于迟发死亡动物，尤其是发尤其是发生生“双峰双峰”死亡死亡现象时现象时，应进行病理组织学检查应进行病理组织学检查，以便为死以便为死因因的确认提供依据。的确认提供依据。 观察记录应尽量准确、具体、完整。不单记录死亡时间，还应记录具体的观察记录应尽量准确、具体、完整。不单记录死亡时间，还应记录具体的中毒表现，并应能表明出现的时间及持续的时间。中毒表现，并应能表明出现的时间及持续的时间。2022-7-545一、孙氏改进寇氏法（点斜法）一、孙氏改进寇氏法（点斜法）二、二、 Bliss 法法2

43、022-7-5461. 1. 基本要求基本要求p反应情况应符合或接近对数正态分布反应情况应符合或接近对数正态分布；p相邻两剂量的比值应相等相邻两剂量的比值应相等；p各组动物数相等或相近各组动物数相等或相近，一般为一般为1010只只；p不要求死亡率一定包括不要求死亡率一定包括0%0%与与100%100%，但二者之和最好但二者之和最好在在 80%80%120% 120% 范围内。范围内。一、孙氏改进寇氏法（点斜法）一、孙氏改进寇氏法（点斜法）2022-7-5472. 2. 计算公式计算公式(1)(1)当最小剂量组的死亡率为当最小剂量组的死亡率为 0 0 %, %, 最大剂量组的死亡率为最大剂量组的

44、死亡率为 100% 100% 时时，按下列公式计算按下列公式计算：LDLD5050 = = l lg g-1 -1 X Xm m i i ( ( P P - - 0.5 ) 0.5 ) (1)(1) 式中式中 X Xm m 为最大剂量的对数为最大剂量的对数； p p 为各组动物的死亡率为各组动物的死亡率 ( ( 以小数表示以小数表示 ) )； P P 为各组动物死亡率的总和为各组动物死亡率的总和 ( (P P1 1 十十P P + +P P3 3 ) ) i i 为组间距为组间距 ( ( 相邻两组对数剂量的差值相邻两组对数剂量的差值 ) ) 。一、孙氏改进寇氏法（点斜法）一、孙氏改进寇氏法（点

45、斜法）2022-7-5482. 2. 计算公式计算公式（2 2）当最小剂量组的死亡率大于当最小剂量组的死亡率大于0%0%而又小于而又小于30%30%，或最大或最大剂量组的死亡率小于剂量组的死亡率小于100%100%而又大于而又大于70%70%时时： 式中式中 PmPm 为最大剂量组的死亡率为最大剂量组的死亡率 ; ; PnPn 为最小剂量组的死亡率。为最小剂量组的死亡率。一、孙氏改进寇氏法（点斜法）一、孙氏改进寇氏法（点斜法）LD50 = lg-1 Xm - i ( P-3 Pm - Pn) (2)42022-7-5492. 2. 计算公式计算公式（3 3）LDLD5050 的标准误差按下式计

46、算的标准误差按下式计算: : 式中式中 S Sx x5050 为为 lgLDlgLD5050的标准误差的标准误差； X X5050即即lgLDlgLD50 50 ； n n为每组动物数为每组动物数。一、孙氏改进寇氏法（点斜法）一、孙氏改进寇氏法（点斜法）Sx50 = i ( P- P2 ) (3)n - 12022-7-5502. 2. 计算公式计算公式（4 4）LDLD5050的的95%95%可信限按下式计算可信限按下式计算 一、孙氏改进寇氏法（点斜法）一、孙氏改进寇氏法（点斜法） 95%95%可信限可信限 = = lglg-1-1 ( ( X X50501.96 S1.96 Sx x505

47、0 ) (4) (4)2022-7-551例题例题 取体重取体重18-22g18-22g小鼠小鼠5050只只，雌雄各半雌雄各半，随机随机分成分成5 5组组，每组每组1010只只，按表按表1-81-8中剂量腹腔注射中剂量腹腔注射PAMPAM溶液溶液，组间剂量比为组间剂量比为1:0.81:0.8，死亡率见表死亡率见表1-81-8，用改良寇氏法计算其半数致死量、标准误差和用改良寇氏法计算其半数致死量、标准误差和 95% 95% 可信区间。可信区间。 2022-7-552按式按式（1）计算计算 LD50 现现 Xm=2.48，i =0.10， P=2.6LD50 = lg-1 Xm i (P - 0.

48、5 ) = lg-1 2.48 0.1 ( 2.6 - 0.5 ) = lg-1 2.27 = 186.21mg/kg2022-7-553按式按式 (3) 计算计算 LD50 的标准误差的标准误差 现现 n = 10， P2 = 1.98 Sx50 = i ( P- P2 )n - 1 = 0.10 2.6 1.9810 - 1 = 0.0069 2022-7-554按式按式 (4) 计算计算 LD50 的的 95% 可信限可信限95% 可信限可信限 = lg-1 ( X50 士士 1.96 Sx50 ) = lg-1 ( lg186.21 士士 1.96 0.0069 ) = lg-1 (

49、2.27 士士 0.0135 ) = lg-1 ( 2.2565 2.2835 ) = 180.51 192.09 mg/kg答：答：PAM 对小鼠腹腔注射的对小鼠腹腔注射的 LD50 为为 186.21 mg/ kg ，标准误差为标准误差为 0.0069， 95% 可信限为可信限为 180.51 192.09 mg/kg 。2022-7-555 利用对数剂量与反应百分率的转换数（几率利用对数剂量与反应百分率的转换数（几率单位）呈直线关系而设计。又称之为加权几率单单位）呈直线关系而设计。又称之为加权几率单位法或几率单位正规法。位法或几率单位正规法。 二、二、Bliss法法2022-7-556B

50、liss法计算步骤法计算步骤1将实验所得的反应率由百分率与概率单位转换表查出概将实验所得的反应率由百分率与概率单位转换表查出概率单位称经验概率单位率单位称经验概率单位(yem)。2在坐标纸上，根据对数剂量与在坐标纸上，根据对数剂量与yem构成点，用目测法绘构成点，用目测法绘制一条直线，绘制时应适当照顾靠近概率单位等于制一条直线，绘制时应适当照顾靠近概率单位等于 5的的点，并由直线找出各对数剂量点，并由直线找出各对数剂量(包括产生包括产生P=0或或P=1的对的对数剂量数剂量)相当的概率单位称期望概率单位相当的概率单位称期望概率单位(Y) 。二、二、Bliss法法2022-7-557Bliss法计