4.免疫电镜细胞化学技术课件.ppt

1、 免疫免疫电镜细电镜细胞化学技胞化学技术术电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术 电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。 目的：目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与功能的相互关系。 免疫电镜技术免疫电镜技术 免疫免疫电镜电镜技技术术是免疫化学技是免疫化学技术术与与电镜电镜技技术结术结合的合的产产物，根据抗原抗体的高度特异性物，根据抗原抗体的高度特异性结结合原理，用高合原理，用高电电子密子

2、密度的度的标记标记物（如：金、物（如：金、铁铁蛋白等）在超微蛋白等）在超微结结构水平上构水平上检测检测某些抗原性物某些抗原性物质质的定位、定性、半定量的一种方法。的定位、定性、半定量的一种方法。 目前免疫目前免疫电镜电镜技技术术主要包括主要包括酶酶免疫免疫电镜电镜技技术术，免疫，免疫铁铁蛋白技蛋白技术术和免疫胶体和免疫胶体金技金技术术，此外，此外还还有抗体有抗体杂杂交技交技术术、凝集素、凝集素电镜标记电镜标记技技术术和和铁铁蛋白蛋白-抗抗铁铁蛋白蛋白电镜电镜复合物技复合物技术术。 。用以用以标记标记抗体的抗体的酶酶要具要具备备以下条件：以下条件：1.与抗体（或抗原）与抗体（或抗原）结结合后，仍

3、能保持合后，仍能保持酶酶和抗体（或抗原）的生物活性。和抗体（或抗原）的生物活性。2.酶酶的的纯纯度高、特异性度高、特异性强强、 、稳稳定、可溶性好、敏感、廉价。定、可溶性好、敏感、廉价。3.在体液或在体液或组织组织中不存在中不存在该酶该酶的底物。的底物。酶标酶标技技术术中最常用的中最常用的标记酶标记酶是辣根是辣根过过氧化物氧化物酶酶（ （HRP） ）电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则 1 1、取材与固定、取材与固定 取材原则与常规电镜取材相同，力求保持组织新鲜，标本固定要求取材原则与常规电镜取材相同，力求保持组织新鲜，标本固定要求是既要保持组织成分的抗原性，又

4、要保存细胞的超微结构。低浓度的是既要保持组织成分的抗原性，又要保存细胞的超微结构。低浓度的甲醛短时固定队抗原性保存好，但是超微结构保存又受影响。甲醛短时固定队抗原性保存好，但是超微结构保存又受影响。 （1 1）2%2%多聚甲醛液多聚甲醛液 （2 2）2%2%多聚甲醛多聚甲醛-0.01%-0.01%0.05%0.05%戊二醛戊二醛 （3 3）4%4%多聚甲醛多聚甲醛-0.5%-0.5%苦味酸苦味酸-0.5%-0.5%戊二醛戊二醛 2通通过过冰冰冻冻切片或震切片或震动动切片切片获获得厚切片。得厚切片。 冰冰冻冻切片切片 8m ，震，震动动切片切片2080m。 。 3漂洗后的厚切片可按免疫漂洗后的厚

5、切片可按免疫组组化步化步骤进骤进行行标记标记染色。染色。4 DAB显显色后再色后再进进行行锇锇酸后固定以及酸后固定以及电镜电镜包埋切片包埋切片处处理。理。5. 如果确定待如果确定待测测抗原的抗原性不会由于脱水包埋引起失活抗原的抗原性不会由于脱水包埋引起失活的前提下可在包埋切片后做的前提下可在包埋切片后做标记标记染色。染色。三、免疫染色三、免疫染色包埋前染色：是指在未经包埋的预切厚片上先进行免疫染色，然后再包埋前染色：是指在未经包埋的预切厚片上先进行免疫染色，然后再进行脱水包埋超薄切片。进行脱水包埋超薄切片。 优点：优点：（1 1）切片染色前未经四氧化锇固定、脱水、包埋等处理，切片染色前未经四氧

6、化锇固定、脱水、包埋等处理，对抗原性破坏较小。（对抗原性破坏较小。（2 2）可在定位后再进行超薄切片，提高阳性检）可在定位后再进行超薄切片，提高阳性检出率出率. .（3 3）免疫染色后，用四氧化锇后固定，有利于膜型结构的保存）免疫染色后，用四氧化锇后固定，有利于膜型结构的保存。包埋后染色：是指在超薄切片上进行免疫染色。包埋后染色：是指在超薄切片上进行免疫染色。优点：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫试剂分子穿透障碍，不需优点：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫试剂分子穿透障碍，不需要穿透剂。要穿透剂。2.2.免疫染色免疫染色 直接法：用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，直接法：用酶标抗体直接

7、与标本中的相应抗原反应结合，尔后进行酶与底物反应，终产物沉淀在抗原抗体反应部位尔后进行酶与底物反应，终产物沉淀在抗原抗体反应部位。 间接法：依次使用两种不同抗体，先使用未标记的特异性间接法：依次使用两种不同抗体，先使用未标记的特异性抗体即第一抗体，后者与标本中的抗原反应。然后使用过抗体即第一抗体，后者与标本中的抗原反应。然后使用过氧化物酶标记第二抗体，最后酶与底物反应，生产沉淀。氧化物酶标记第二抗体，最后酶与底物反应，生产沉淀。结结果判定果判定在已知阳性、阴性在已知阳性、阴性样样品成立的前提下，出品成立的前提下，出现现高高电电子密度的子密度的颗颗粒，即指示抗原抗体的存在。粒，即指示抗原抗体的存

8、在。（二）胶体金免疫（二）胶体金免疫电镜电镜技技术术 利用胶体金在碱性利用胶体金在碱性环环境中境中带负电带负电荷的性荷的性质质，使其与，使其与抗体相互吸引从而将抗体抗体相互吸引从而将抗体标记标记。再以金。再以金标记标记的抗体与待的抗体与待检检抗原相互抗原相互结结合，由于金合，由于金颗颗粒的粒的电电子密度高，子密度高，电镜观电镜观察察到金到金颗颗粒的位置，即抗原所在。粒的位置，即抗原所在。2、胶体金的特性 颜色：胶体金的颜色与金粒子的直径有关，5-60nm时为红色，95nm是为蓝色，用于免疫细胞化学的胶体金呈红葡萄酒色。 影响胶体金稳定的因素： a.电解质：少量有促进稳定的作用，过量则破坏。 b

9、.胶体金的浓度：浓度越高容易导致胶体金凝集。 c.温度：长时间加热可使稳定性有所下降。 檬酸三钠的用量与胶体金直径的关系0.01%氯化金 1%柠檬酸三钠 胶体金颗粒直径 （ml) （ml） （nm）100 3.0 19.0100 4.0 15.0100 6.0 12.5100 1.5 24.5100 1.0 41.0100 0.6 71.5（ （1）胶体金的制）胶体金的制备备 柠柠檬酸三檬酸三钠还钠还原法（原法（15nm） ） 鞣酸鞣酸-柠柠檬酸檬酸钠还钠还原法（原法（6nm） ） 鞣酸-柠檬酸钠还原法制备不同大小胶体金颗粒的配方1%柠檬酸三钠 1%鞣酸 0.025 mol/L K2CO3 去

10、离子双蒸水 胶体金颗粒直径 （ml) （ml） （ml） （ml） （nm） 4 0.02 0 19.98 15 4 0.1 0 19.90 10 4 0.5 0.5 15.00 6.0 4 3 3 14.00 3.5优优点：点： 胶体金能胶体金能稳稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不的生物活性不发发生明生明显显的的变变化。化。 金金颗颗粒具有很高的粒具有很高的电电子密度，在子密度，在电镜电镜下金下金颗颗粒清晰可辨，易精确定位。粒清晰可辨，易精确定位。不不仅仅可以用于透射可以用于透射电镜电镜的超薄切片的超薄切片观观察，也可以用于察，也可以用于扫扫描描电镜对细电

11、镜对细胞表面的抗原、受体胞表面的抗原、受体进进行行标记标记定位定位观观察。察。胶体金胶体金标记标记物易于制物易于制备备，而且可以根据需要制，而且可以根据需要制备备不同不同大小的胶体金，因此可以大小的胶体金，因此可以进进行免疫行免疫电镜电镜的双重的双重标记标记。 。根据抗原抗体反根据抗原抗体反应应部分部分结结合金合金颗颗粒数量的多少，可粒数量的多少，可进进行粗略的免疫行粗略的免疫细细胞化学定量研究。胞化学定量研究。 （ （2） ）电镜电镜包埋前免疫金染色包埋前免疫金染色 新新鲜组织经鲜组织经适当固定（适当固定（0.5%戊二戊二醛醛-2%多聚甲多聚甲醛醛固固定定0.51h），制成厚切片。），制成厚

12、切片。 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗漂洗3次，每次次，每次15min。 。 0.1mol/L甘氨酸漂洗甘氨酸漂洗10min， ，灭灭活自由活自由醛醛基。基。 TBS漂洗，漂洗，5min3次，次， 1%牛血清孵育牛血清孵育组织块组织块30min。 。 第一抗体第一抗体4孵育孵育过过夜后室温夜后室温继续继续放置放置2h。 。 TBS漂洗，漂洗，5min3次，次， 室温下适当稀室温下适当稀释释度的胶体金度的胶体金标记标记探探针针（二抗胶体金探（二抗胶体金探针针或蛋白或蛋白A胶体金探胶体金探针针等）孵育等）孵育60min。 。 TBS漂洗，漂洗，3min3次，后再用双蒸水漂洗切片。次，后

13、再用双蒸水漂洗切片。 2%戊二戊二醛醛-2多聚甲多聚甲醛醛固定固定1h， ，1%锇锇酸固定酸固定3060min，常，常规规脱水，包埋，切片染色后脱水，包埋，切片染色后电镜观电镜观察。察。（3）电镜包埋后免疫金染色法 超薄切片5070nm，置于镍网或金网中。1% H2O2蚀刻，使试剂能穿透标本。EPON包埋的组织蚀刻时间约10min，而LRWhite、LR Gold包埋的组织蚀刻时间则常小于5min. 双蒸水漂洗双蒸水漂洗3次，每次次，每次10min。 。 1%牛血清孵育切片牛血清孵育切片15min。 。 载载网不冲洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室温孵育网不冲洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室

14、温孵育12h或或41824h。 。 TBS漂洗，漂洗，3min3次。次。 室温下适当稀室温下适当稀释释度的胶体金度的胶体金标记标记探探针针（二抗胶体金探（二抗胶体金探针针或蛋白或蛋白A胶体金探胶体金探针针等）孵育等）孵育3060min。 。 TBS漂洗，漂洗，3min3次，后在用双蒸水漂洗切片。次，后在用双蒸水漂洗切片。 醋酸醋酸铀铀和硝酸和硝酸铅轻铅轻微染色后微染色后电镜观电镜观察。察。2.电镜免疫金染色 用于电镜的免疫金法可以采用包埋前染色和包埋后染色，可根据抗原的性质加以选择。 染色方法也有直接法和间接法。(5)染色染色结结果判断果判断假阳性染色和假阴性染色假阳性染色和假阴性染色可以通可

15、以通过调过调整固定液种整固定液种类类、 、浓浓度、固定度、固定时间时间，改，改变变一抗一抗和二抗胶体金探和二抗胶体金探针浓针浓度、孵育度、孵育时间时间、温度等减少假阳、温度等减少假阳性和假阴性染色。性和假阴性染色。双标记菌毛上两种抗原，胶体金5nm, 20nm图7-11 血小板表面胶体金标记GPIb单抗 9000铁蛋白标记电镜免疫细胞化学技术 铁蛋白标记抗体是由Singer（1959）首创的一种免疫细胞化学技术。这技术曾广泛应用于病毒和细胞表面抗原的检测。铁蛋白作为电镜观察的标记物，具有颗粒大、分辨率高、散射力强的特点，可用于细胞膜表面抗原的准确定位。所以，虽然40年后的今天已发展了多种免疫电

16、镜细胞化学技术，但铁蛋白标记法仍然是一种基本技术。 基本原理：基本原理： 铁蛋白是一种直径铁蛋白是一种直径101012nm12nm的球形的蛋白质（分的球形的蛋白质（分子量子量450kD450kD）, ,它含有致密的铁胶粒核心（直径约它含有致密的铁胶粒核心（直径约7.5nm7.5nm），该核心含），该核心含2000200050005000个铁原子，分布于四个区域个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，因此，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，因此可用于电镜观察。抗体与铁蛋白通过低分子量的偶联可用于电镜观察。抗体与铁蛋白通过低分子量的偶联剂形成抗体剂形成抗体- -铁蛋

17、白复合物，此复合物既保留抗体的免铁蛋白复合物，此复合物既保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有高电子密度的铁胶粒核疫活性，同时因为铁蛋白含有高电子密度的铁胶粒核心，便于电镜观察。心，便于电镜观察。 病毒免疫病毒免疫电镜电镜技技术术 1、标本染液混合染色法： 2、琼脂扩散技术： 检测的材料中病毒含量不足时，为了达到浓缩病毒的目的，并去除材料中所含盐分，可采用琼脂扩散法。 用0.8%琼脂铺好的琼脂块，把含病毒的悬液滴到琼脂块上，然后把载网倒悬在这滴悬液上。琼脂块把水分吸收，浓缩的病毒沾附在载网上，再经过负染色后进行电镜观察。3、假复型技术：方法：方法：4 4、病毒、病毒颗颗粒免疫粒免疫电镜电镜技技术术： ：样品制备步骤：