荧光免疫技术-精品课件.ppt
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1、第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术目录目录 返回总目录返回总目录概述概述1荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术2共聚焦显微技术共聚焦显微技术3荧光免疫测定技术荧光免疫测定技术4免疫芯片技术免疫芯片技术5第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术第一节第一节 概述概述一、荧光的基本知识一、荧光的基本知识 某些物质受到一定波长光的激发后会发射某些物质受到一定波长光的激发后会发射荧光(荧光(fluorescence)。不同的荧光物质具有。不同的荧光物质具有不同的发射光谱、激发光谱和荧光寿命。不同的发射光谱、激发光谱和荧光寿命。
2、第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术(一)(一)荧光技术中有关的概念和参数荧光技术中有关的概念和参数荧光:荧光:某些物质受到一定波长光的激发后跃某些物质受到一定波长光的激发后跃迁到迁到激发态激发态,当其在极短时间内回复至,当其在极短时间内回复至基态基态发射出的波长大于激发光波长的光。发射出的波长大于激发光波长的光。 发射光谱:发射光谱:指固定激发波长,在不同波长指固定激发波长,在不同波长下记录到的样品所发射的下记录到的样品所发射的荧光强度荧光强度。第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术激发光谱:激发光谱:指固定检测发射波长,用不同波长的激指固定检测发射波长,用不同波长的激发光激发样品所记录到
3、的相应的荧光发射强度。发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。 Stokes位移:位移:荧光物质从激发态回到基态过程中,荧光物质从激发态回到基态过程中,部分能量丢失,发射光波长比激发光波长长。部分能量丢失,发射光波长比激发光波长长。 荧光效率:荧光效率:荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率。分率。吸收光的光量子数(激发光强度)吸收光的光量子数(激发光强度)荧光效率荧光效率 = =发射荧光的光量子数(荧光强度)发射荧光的光量子数(荧光强度)第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术荧光寿命:荧光寿命:指荧光物质被激发后所产生的荧光衰减指荧光物质被激发后所产生的荧
4、光衰减到一定程度时所用的时间。到一定程度时所用的时间。 荧光的淬灭:荧光的淬灭:荧光物质在某些理化因素或受到激发荧光物质在某些理化因素或受到激发光较长时间的照射作用,会发生发射荧光减弱甚至光较长时间的照射作用,会发生发射荧光减弱甚至消退的现象。消退的现象。 荧光偏振:荧光偏振: 当当P=0时,表明时,表明完全不偏振完全不偏振;P在在-1至至+1之间为之间为部分偏振部分偏振。FH +FLP=FH FL第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术(二)(二)影响荧光的因素影响荧光的因素pH温度温度荧光素的浓度荧光素的浓度试剂中杂质试剂中杂质细胞固定剂细胞固定剂第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术 (三
5、)(三) 荧光物质荧光物质1. 1. 荧光色素:荧光色素:FITC、RB200、TRITC、PE、ECD、PeCy5、PeCy7、APC、PI。2. 2. 镧系螯合物镧系螯合物 :Eu3+ 等。等。第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术荧光物质荧光物质最大吸收最大吸收光谱(光谱(nm)最大发射最大发射光谱(光谱(nm)荧光荧光颜色颜色应用应用 FITC490495520530 黄绿色黄绿色FAT、荧光偏振免疫测定流式细胞、荧光偏振免疫测定流式细胞术术RB200570 595600 桔红色桔红色FITC的衬比染色或双标记的衬比染色或双标记FATTRITC550 620 橙红色橙红色FITC的衬比
6、染色或双标记的衬比染色或双标记FAT,也可单独采用也可单独采用PE488、532575 红色红色可与可与FITC共用共用488nm激发光双标激发光双标记记FAT、流式细胞术、流式细胞术ECD488620桔红色桔红色流式细胞术流式细胞术PeCy5488、532670红色红色流式细胞术流式细胞术PeCy7488、532755深红色深红色流式细胞术流式细胞术PI488620橙红色橙红色DNA染色染色APC633670红色红色双激光管的仪器分析双激光管的仪器分析Eu3+螯合物螯合物340 613 时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定表表8-1 8-1 常用荧光物质的荧光特点常用荧光物质的荧光特点第
7、八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术FITCTRITC第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术二、荧光抗体的制备二、荧光抗体的制备(一)荧光素标记物的制备(一)荧光素标记物的制备1. 抗体的要求:抗体的要求:抗体应具有高特异性、高纯度和抗体应具有高特异性、高纯度和高亲和力,经纯化后标记。高亲和力,经纯化后标记。2. 2. 荧光素要求:荧光素要求:结合后不易解离,而未结合的结合后不易解离,而未结合的易于去除,结合后仍保持较高的荧光效率和易于去除,结合后仍保持较高的荧光效率和不影响蛋白质原有的生化与免疫性质,荧光不影响蛋白质原有的生化与免疫性质,荧光色泽与背景色泽对比鲜明,结合物稳定,安色泽与背景色
8、泽对比鲜明,结合物稳定,安全无毒,易于保存。全无毒,易于保存。第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术标记方法标记方法方法学评价方法学评价搅搅拌拌法法待标记的蛋白质在磁待标记的蛋白质在磁力搅拌下加入力搅拌下加入FITC溶液溶液标记体积大、蛋白含量高的抗体标记体积大、蛋白含量高的抗体,标记时间短,荧光素用量少,标记时间短,荧光素用量少,但影响因素多,易引起非特异性但影响因素多,易引起非特异性染色。染色。透透析析法法待标记的蛋白质装入待标记的蛋白质装入透析袋后置于透析袋后置于FITC的缓冲液中过夜的缓冲液中过夜标记样品量少、蛋白含量低的抗标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液,标记均匀,非特异性荧体溶液
9、,标记均匀,非特异性荧光染色弱,但荧光素用量较大。光染色弱,但荧光素用量较大。3. 3. 荧光素标记抗体的方法:见表荧光素标记抗体的方法:见表8-28-2。第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术(1)(1)去除游离荧光素及其降解产物:透析或凝胶过滤去除游离荧光素及其降解产物:透析或凝胶过滤; ;(2)(2)去除荧光素未结合和结合过度的抗体:阴离子交去除荧光素未结合和结合过度的抗体:阴离子交换层析法换层析法; ;(3)(3)去除交叉反应或非期望抗体:动物肝粉吸收或固去除交叉反应或非期望抗体:动物肝粉吸收或固相抗原吸收。相抗原吸收。4. 4. 荧光素标记抗体的纯化荧光素标记抗体的纯化第八章第八章
10、荧光免疫技术荧光免疫技术 荧光素与蛋白结合率、抗体效价、抗体特荧光素与蛋白结合率、抗体效价、抗体特异性、抗体抗体特异性染色滴度。异性、抗体抗体特异性染色滴度。 加入加入0.1%NaN3或或0.01%硫柳汞防腐,避免硫柳汞防腐,避免反复冻融,反复冻融,-20冻存可保存冻存可保存12年,真空干燥年,真空干燥后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存。后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存。5. 5. 荧光素标记抗体的鉴定荧光素标记抗体的鉴定6. 6. 荧光记抗体的保存荧光记抗体的保存第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术(二)镧系元素标记物的制备(二)镧系元素标记物的制备 1.1.镧系元素标记物:
11、镧系元素标记物:铕(铕(Eu3+3+)、钐()、钐(Sm3+3+)、)、 铽(铽(Tb3+3+)、钕()、钕(Nd3+3+)和镝()和镝(Dy3+3+)。)。 2.2.标记方法:标记方法:一步法、二步法。一步法、二步法。第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术三、荧光免疫技术的原理及类型三、荧光免疫技术的原理及类型 用荧光物质标记抗体或抗原,让其与相应抗用荧光物质标记抗体或抗原,让其与相应抗原或抗体结合后,借荧光检测仪检测抗原抗体原或抗体结合后,借荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光的存在情况及其存在的部复合物中特异性荧光的存在情况及其存在的部位和强度,以判断抗原或抗体存在的位置、分位和强度
12、,以判断抗原或抗体存在的位置、分布和含量。布和含量。第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术(一)(一)荧光免疫显微技术:荧光免疫显微技术:用荧光素标记抗体与组用荧光素标记抗体与组织切片或细胞表面的抗原反应,洗涤除去游离的织切片或细胞表面的抗原反应,洗涤除去游离的荧光抗体后,在荧光显微镜下直接观察特异性荧荧光抗体后,在荧光显微镜下直接观察特异性荧光。光。(二)(二)荧光免疫测定技术:荧光免疫测定技术:以荧光物质标记抗体或以荧光物质标记抗体或抗原,与相应抗原或抗体结合,用荧光检测仪检抗原,与相应抗原或抗体结合,用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度,对固体或测抗原抗体复合物中特异性荧光强度
13、,对固体或液体标本中微量物质定量测定。液体标本中微量物质定量测定。返回章目录返回章目录技术类型技术类型第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术第二节第二节 荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术 以荧光显微镜为检测工具,用荧光素标记抗以荧光显微镜为检测工具,用荧光素标记抗体或抗抗体,检测组织切片中的细胞抗原或血清体或抗抗体,检测组织切片中的细胞抗原或血清中的抗体,观察特异性荧光,用于样本的定性和中的抗体,观察特异性荧光,用于样本的定性和定位检查。定位检查。 第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术一、标本的制作一、标本的制作1.1.抗原在染色、洗涤和封埋过程中应保持抗原的抗原在染色、洗涤和封埋过程中应保
14、持抗原的完整性。完整性。2.2.标本切片要求薄。标本切片要求薄。3.3.常见的临床标本有组织、细胞和细菌三大类,常见的临床标本有组织、细胞和细菌三大类,可制作成涂片、印片或切片。可制作成涂片、印片或切片。 4.4.除活细胞外,其他标本片应固定。除活细胞外,其他标本片应固定。第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术(一)直接法(一)直接法荧光素标记抗体荧光素标记抗体F FF F抗原抗原二、荧光抗体染色的技术类型二、荧光抗体染色的技术类型第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术(二)间接法(二)间接法F FF F荧光素标荧光素标记抗体记抗体抗原抗原抗体抗体第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术(1)抗
15、原间接定位法)抗原间接定位法荧光标记的第二抗体荧光标记的第二抗体 (二抗)(二抗)组织中的抗原组织中的抗原第一抗体(一抗)第一抗体(一抗)第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术(2)抗体间接定位法)抗体间接定位法荧光标记抗体荧光标记抗体组织中的抗体组织中的抗体抗原抗原 第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术 用两种荧光素分别标记两种不同的特用两种荧光素分别标记两种不同的特异性抗体,对同一标本进行荧光染色,异性抗体,对同一标本进行荧光染色,洗涤后在荧光显微镜下用两种不同的激洗涤后在荧光显微镜下用两种不同的激发光激发,若有两种抗原存在,可显示发光激发,若有两种抗原存在,可显示两种颜色的荧光。两种颜
16、色的荧光。 (三)双标记法(三)双标记法第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术(1)直接法)直接法A荧光标记的荧光标记的抗甲抗原抗体抗甲抗原抗体B荧光标记的荧光标记的抗乙抗原抗体抗乙抗原抗体甲甲抗原抗原乙乙抗原抗原第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术抗甲抗原抗体抗甲抗原抗体抗乙抗原抗体抗乙抗原抗体甲抗原甲抗原乙抗原乙抗原(2)间接法)间接法乙荧光标乙荧光标记二抗记二抗甲荧光标甲荧光标记二抗记二抗第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术三、荧光显微镜三、荧光显微镜第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术操作操作特异性特异性非特异性非特异性敏感性敏感性临床应用临床应用直接法直接法简便简便强强少少偏低
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