糖生物学与分子诊断课件.ppt

1、糖生物学与分子诊断一、概述一、概述糖类化合物糖类化合物是多羟基醛或多羟基酮及其缩聚物是多羟基醛或多羟基酮及其缩聚物和某些衍生物的总称和某些衍生物的总称 糖类物质可以根据其水解情况分为：糖类物质可以根据其水解情况分为：MonosaccharideMonosaccharide 单糖单糖OligosaccharideOligosaccharide 寡糖寡糖PolysaccharidePolysaccharide 多糖多糖在生物体内：在生物体内：均一多糖均一多糖 homopolysaccharide杂多糖杂多糖 heteropolysaccharide糖复合物糖复合物 glycoconjugate：

2、糖复合物糖复合物 glycoconjugateglycoconjugate糖类与蛋白或脂糖类与蛋白或脂类形成共价结合物类形成共价结合物。 vGlycobiology:v糖类作为生物能源分子的重要性在经典的生物化学领域中早已得到广泛的探讨和论述，然而这部分内容只是当代糖生物学研究的一个小小的分支.v糖生物学主要关注的是糖类作为信息分子和调节分子在生物体的各项正常生命活动和病理状态下所发挥的作用. Glycobiology: Study of the structure, chemistry, biosynthesis, and biological functions of glycans an

3、d their derivatives.糖生物学（Glycobiology）：是研究糖类（即碳水化合物）及其衍生物的结构、代谢、生物学功能、以及与疾病的关系的科学，是当代生物有机化学和分子细胞生物学的一个活跃的交叉学科前沿。 Wenzhou Medical University 淋巴细胞表面的糖基是使它正确进入淋巴淋巴细胞表面的糖基是使它正确进入淋巴组织的决定因子组织的决定因子, ,如果用岩藻糖酶处理淋巴如果用岩藻糖酶处理淋巴细胞后细胞后, ,后者不能进入脾脏改进入肝脏后者不能进入脾脏改进入肝脏Wenzhou Medical University 内质网中新内质网中新合成的溶酶合成的溶酶体酶靠

4、糖链体酶靠糖链上的上的6-6-磷酸磷酸甘露糖标记，甘露糖标记，得以通过胞得以通过胞内分发系统内分发系统进入行使功进入行使功能。能。糖类作为信息分子糖类作为信息分子在受精、发生、发育、分化，神经系统和免疫系统衡在受精、发生、发育、分化，神经系统和免疫系统衡态的维持等方面起着重要作用态的维持等方面起着重要作用炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增殖和转炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增殖和转换、病原体感染换、病原体感染植物和病原体相互作用植物和病原体相互作用植物与根瘤菌共生等生理和病理过程都有糖类的介导植物与根瘤菌共生等生理和病理过程都有糖类的介导以以18431843年杜马年杜马(Duma

5、s)(Dumas)提出糖类实验式提出糖类实验式 1919世纪世纪8O8O年代年代(Fischer) (Fischer) 单糖分子结构单糖分子结构 18971897年年 (Buchner)(Buchner)发现酵母无细胞提取液糖发现酵母无细胞提取液糖酒精酒精 2O2O世纪世纪3O3O年代糖酵解途径的基本阐明年代糖酵解途径的基本阐明 2O2O世纪世纪6060年代中叶细胞信息的职能年代中叶细胞信息的职能 2O2O世纪世纪8O8O年代下半叶对糖类分子的研究终于形成一个明显年代下半叶对糖类分子的研究终于形成一个明显的新高潮的新高潮 2020世纪末由几个糖生物学家同时提出了世纪末由几个糖生物学家同时提出了

6、“糖组糖组”的概念的概念19881988，Raymond Dwek Raymond Dwek 提出提出 糖生物学糖生物学(Glycobiology)(Glycobiology)的概念的概念 (Annuel Review of Biochemistry)19911991，国际性杂志，国际性杂志 Glycobiology Glycobiology创刊创刊糖生物学：研究糖缀合物糖链的结构、生物合成和糖生物学：研究糖缀合物糖链的结构、生物合成和生物学功能的一门学科。生物学功能的一门学科。涉及到学科：分子生物学、细胞生物学、病理学、涉及到学科：分子生物学、细胞生物学、病理学、免疫学、神经生物学等免疫学、

7、神经生物学等各国政府对糖生物学研究的支持各国政府对糖生物学研究的支持 美国能源部（美国能源部（19861986）资助佐治亚大学创建了复）资助佐治亚大学创建了复合糖类研究中心合糖类研究中心(CCRC)(CCRC)，建立复合糖类数据库，建立复合糖类数据库(CCSD)(CCSD)。 20012001年年9 9月：启动月：启动 “ “功能糖组学功能糖组学”研究，目标：研究，目标：阐明由蛋白质阐明由蛋白质- -糖链相互作用所介导的细胞通糖链相互作用所介导的细胞通讯机制。讯机制。 由美国由美国MITMIT主办、付款订户超过主办、付款订户超过3030万、在预测和万、在预测和评估高科技发展趋势和指导风险投资方

8、面具有权威评估高科技发展趋势和指导风险投资方面具有权威性地位的杂志性地位的杂志Technology ReviewTechnology Review，在，在20032003年年1 1月月2121日出版的一期中，日出版的一期中，将糖组学确定为行将改变世界的将糖组学确定为行将改变世界的十大新兴技术之一十大新兴技术之一。在。在20032003年年GlycoSuiteDBGlycoSuiteDB（5.05.0版）版）糖组数据库中，已经积累了来自糖组数据库中，已经积累了来自187187个物种、总数超个物种、总数超过过81008100种的糖链结构，其中有种的糖链结构，其中有890890种种N N- -连接寡

9、糖链、连接寡糖链、709709种种O O- -连接寡糖链、以及连接寡糖链、以及8585种其种其他类型糖链的结构他类型糖链的结构已经完全测定清楚。已经完全测定清楚。 糖科学与糖组学的意义糖科学与糖组学的意义Gest和和 Schopf：“以糖类为基础的细胞体系以糖类为基础的细胞体系为生物化学层次和细胞层次上的进化提供了成功为生物化学层次和细胞层次上的进化提供了成功的起点的起点”。Scientists are saying that glycomics could fuel a revolution in biology to rival that of the human genome. New

10、Scientist, Oct. 2002 Sharon, N. ：糖科学研究是：糖科学研究是“分子细胞生物分子细胞生物学领域最后一个遗留的前沿学领域最后一个遗留的前沿” 糖组学糖组学( (糖蛋白糖蛋白)-)-涉及单个个体的全部糖蛋白结涉及单个个体的全部糖蛋白结构分析，确定编码糖蛋白的基因和蛋白质糖基化的构分析，确定编码糖蛋白的基因和蛋白质糖基化的机制机制糖组学主要解决糖组学主要解决4 4个方面问题：个方面问题：a a什么基因编码糖蛋白，即基因信息；什么基因编码糖蛋白，即基因信息；b b可能糖基化位点中实际被糖基化的位点，即糖基可能糖基化位点中实际被糖基化的位点，即糖基化位点信息；化位点信息；C

11、 C聚糖结构，即结构信息；聚糖结构，即结构信息；d d糖基化功能，即功能信息糖基化功能，即功能信息二、糖复合物的结构与功能二、糖复合物的结构与功能 糖蛋白糖蛋白GlycoproteinsGlycoproteins: : 由糖和多肽或蛋白质以共由糖和多肽或蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白。糖含量价键连接而成的结合蛋白。糖含量1%1%80%80%。不多。不多于于1515个单糖残基个单糖残基 蛋白聚糖蛋白聚糖 GlycoproteinsGlycoproteins ：含大量糖胺聚糖并与：含大量糖胺聚糖并与多肽骨架连接的高分子物质。糖含量多肽骨架连接的高分子物质。糖含量95%95% 糖脂糖脂 Glyco

12、lipidGlycolipid: : ：由糖通过其半缩醛羟基以糖：由糖通过其半缩醛羟基以糖苷键与脂质相连的化合物。苷键与脂质相连的化合物。Wenzhou Medical University膜蛋白中的糖膜蛋白中的糖糖蛋白糖蛋白及糖链及糖链 蛋白质蛋白质糖蛋白糖蛋白 多糖多糖 多糖中多为糖的衍生物，如多糖中多为糖的衍生物，如N-N-乙酰氨基多糖等（常乙酰氨基多糖等（常见的糖是半乳糖或甘露糖）见的糖是半乳糖或甘露糖） 寡糖链多是分支的，一般仅含有寡糖链多是分支的，一般仅含有1515个以下的单糖，个以下的单糖，分子量在分子量在540-3200540-3200。但糖链数目变化很大。但糖链数目变化很大糖

13、链的多样性和复杂性糖链的多样性和复杂性DNADNA中，中，G-C G-C 一种结构一种结构糖链中，糖链中，Man GalMan GalMan Man 可以和可以和 GalGal的的C2C2、C3C3、C4C4、C6C6连接连接44Man GalMan Gal可以用可以用连接连接88甘露糖残基可以以呋喃糖或吡喃糖形式甘露糖残基可以以呋喃糖或吡喃糖形式1616糖链的多样性和复杂性糖链的多样性和复杂性由由4 4个核苷酸组成的寡核苷酸，可能的序列个核苷酸组成的寡核苷酸，可能的序列仅有仅有2424种；种；而由而由4 4个己糖组成的寡糖链，可能的序列则个己糖组成的寡糖链，可能的序列则多达多达3 3万多种。

14、万多种。正是由于糖链结构的复杂性，使其可能包含正是由于糖链结构的复杂性，使其可能包含的信息量比核酸和蛋白质大了几个数量级。的信息量比核酸和蛋白质大了几个数量级。 vGlycobiologyGlycobiology: :糖链具有比核酸和肽链更大的潜在信息编码糖链具有比核酸和肽链更大的潜在信息编码容量容量. .6 6种不同的氨基酸理论上可以形成种不同的氨基酸理论上可以形成10105 5种不同种不同的结构，的结构，而而6 6种不同的单糖则可形成种不同的单糖则可形成10101212种不同结构。种不同结构。 （一）糖蛋白的（一）糖蛋白的糖链结构糖链结构糖型（糖型（glycoformglycoform）：

15、）：带有某种糖链结构的糖蛋白，带有某种糖链结构的糖蛋白，具有相同肽链而糖链结构不同的糖蛋白。这具有相同肽链而糖链结构不同的糖蛋白。这一概念是糖蛋白研究中所特有的一概念是糖蛋白研究中所特有的1、糖链中单糖的种类及连接方式糖链中单糖的种类及连接方式葡萄糖葡萄糖GlcGlc、半乳糖、半乳糖GalGal、甘露糖、甘露糖ManMan岩藻糖岩藻糖FucFuc、葡萄糖胺葡萄糖胺GlcNGlcN 、半乳糖胺、半乳糖胺GalNGalN木糖木糖XylXyl、阿拉伯糖、阿拉伯糖AraAra、N-N-乙酰神经氨酸乙酰神经氨酸NeuNAcNeuNAc、葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸GlcUAGlcUA乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖

16、GlcNAcGlcNAc 糖蛋白中的寡糖链的还原端残基与多肽链的氨基糖蛋白中的寡糖链的还原端残基与多肽链的氨基酸残以多种形式酸残以多种形式共价连接共价连接，形成的连键称为糖肽，形成的连键称为糖肽键或糖苷键键或糖苷键 2、连接方式连接方式糖肽键糖肽键N-N-糖苷键和糖苷键和O-O-糖苷键糖苷键2 2、糖肽键的类型、糖肽键的类型 1 1）N-N-糖肽键：乙酰葡萄糖胺的半缩醛基糖肽键：乙酰葡萄糖胺的半缩醛基C1C1原子与多原子与多肽链上肽链上AsnAsn酰胺酰胺N N原子共价相连原子共价相连多肽链多肽链 一般由一般由6 6个到数十个糖基连接成糖链，糖链有分支，个到数十个糖基连接成糖链，糖链有分支，存

17、在于血浆蛋白，细胞膜和胞质的糖蛋白也普遍存存在于血浆蛋白，细胞膜和胞质的糖蛋白也普遍存在。在。2）O-糖糖肽键：肽键：乙酰半乳糖胺的半缩醛基乙酰半乳糖胺的半缩醛基C1C1原子与原子与多肽链上多肽链上SerSer、ThrThr、Hyl羟基的羟基的O原子共价相连原子共价相连乙酰葡萄糖胺乙酰葡萄糖胺O-GalNAc和N-聚糖的主要区别3、糖链的分类：糖链的分类： 1）N-糖链 五糖核心通常由一个分支的五糖核心和不同数量的外链组成 Man16（Man13）Man14GlcNAc14GlcNAc（乙酰氨基葡萄糖），乙酰葡萄糖胺乙酰葡萄糖胺（2）分型）分型高甘露糖型高甘露糖型：五糖核心以外全部是：五糖核心

18、以外全部是ManMan复合型复合型: :除三甘露糖基核心外，不含除三甘露糖基核心外，不含ManMan，可以高度，可以高度岩藻糖基化、磷酸化或硫酸化，某些还含多唾液岩藻糖基化、磷酸化或硫酸化，某些还含多唾液酸成分酸成分杂合型杂合型: :具有高甘露糖型和复合型两种类型具有高甘露糖型和复合型两种类型 O-O-糖链结构比糖链结构比N-N-糖链简单，但连接形式比糖链简单，但连接形式比N-N-糖链多糖链多: :GalNAc-Ser/Thr, GlcNAc-Ser/ThrGalNAc-Ser/Thr, GlcNAc-Ser/Thr, ,Man-Ser/Thr, Ara-Ser/ThrMan-Ser/Thr,

19、 Ara-Ser/Thr, Gal-Ser, Gal-Ser,Fuc-Ser/Thr,Xyl-Ser/ThrFuc-Ser/Thr,Xyl-Ser/Thr, , GalNAc-Ser/ThrGalNAc-Ser/Thr中有六种核心结构中有六种核心结构2 2）O O- -糖链糖链（二）（二）糖链的生物学功能糖链的生物学功能分子内分子内: : 蛋白质的正确折叠、细胞内定位、生物活性、溶蛋白质的正确折叠、细胞内定位、生物活性、溶解度、抗原性、生物半寿期、蛋白酶敏感性等；解度、抗原性、生物半寿期、蛋白酶敏感性等；分子间分子间: :如趋靶于溶酶体、趋靶于组织、细胞如趋靶于溶酶体、趋靶于组织、细胞- -细

20、胞间粘附和细胞间粘附和结合病原体。结合病原体。介导专一的介导专一的“识别识别”和和“调控调控”生物过程。生物过程。1 1、糖链在糖蛋白新生肽链折叠和缔合中的作用、糖链在糖蛋白新生肽链折叠和缔合中的作用1)1)去糖基化的蛋白不能正确折叠去糖基化的蛋白不能正确折叠维持亚基正常构维持亚基正常构象；象； 1-1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶( (点突变，去糖基化，不能折叠点突变，去糖基化，不能折叠) ) 疱疹口炎病毒（疱疹口炎病毒（VSVVSV）的）的G G蛋白蛋白( (点突变，去糖基点突变，去糖基化，不能形成正确二硫键化，不能形成正确二硫键) )流感病毒红细胞凝集素（流感病毒红细胞凝集素（HA,一种糖蛋白）

21、一种糖蛋白）2）寡聚蛋白中的糖链能影响亚基的缔合寡聚蛋白中的糖链能影响亚基的缔合 亚基间亚基间通过糖链相互识别而发生缔合通过糖链相互识别而发生缔合 运铁蛋白受体二聚体跨膜糖蛋白，运铁蛋白受体二聚体跨膜糖蛋白，6 6条糖链，条糖链，Asn251Asn251突变去糖基化，不能形成二聚体，影响受突变去糖基化，不能形成二聚体，影响受体的转运和功能体的转运和功能, ,而且在细胞内迅速被蛋白酶水解而且在细胞内迅速被蛋白酶水解极性糖链有助于蛋白质的溶解真核细胞中表达的糖蛋白 在原核细胞内聚集成包涵体2 2、糖链影响糖蛋白的稳定性、糖链影响糖蛋白的稳定性3 3、糖链对糖蛋白分拣、投送和分泌的作用、糖链对糖蛋白

22、分拣、投送和分泌的作用 去糖链的免疫球蛋白不能分泌到胞外； N-聚糖中的甘露糖-6-磷酸结构是糖蛋白分拣到溶酶体中的标志，用衣霉素处理细胞阻止N-糖化，可使很多定位于细胞膜上的糖蛋白减少。1）糖链与精卵识别透明带透明带ZP-3ZP-3上的上的O-GalNAcO-GalNAc-卵子卵子（糖蛋白）（糖蛋白） 凝集素受体凝集素受体精子精子花粉表面糖蛋白花粉表面糖蛋白柱头表面受体柱头表面受体4 4、糖链参与分子识别和细胞间识别（识别功能）、糖链参与分子识别和细胞间识别（识别功能）2）糖链和细胞粘着 多细胞生物中细胞有相互识别聚集成细胞群的能力多细胞生物中细胞有相互识别聚集成细胞群的能力细胞粘着细胞粘着

23、 细胞外基质细胞外基质(ECM)(ECM)：糖蛋白（层粘连蛋白：糖蛋白（层粘连蛋白 lamininlaminin、胶原、胶原CollagenCollagen、纤粘连蛋白、纤粘连蛋白 FibronectinFibronectin ）、氨基聚糖及蛋）、氨基聚糖及蛋白聚糖白聚糖 膜内在蛋白：整联蛋白、钙粘着蛋白等膜内在蛋白：整联蛋白、钙粘着蛋白等 糖蛋白上的糖链的糖蛋白上的糖链的作用主要有两大类：作用主要有两大类： 一是分子内的作用，一是分子内的作用，如糖蛋白新生肽链的正如糖蛋白新生肽链的正确折叠、蛋白质的转运确折叠、蛋白质的转运和分泌、细胞内定位、和分泌、细胞内定位、抗原性等；抗原性等； 二是分子

24、间的作用，二是分子间的作用，如细胞粘着、分子识别、如细胞粘着、分子识别、信号转导、趋靶于组织信号转导、趋靶于组织和结合病原体等。和结合病原体等。三、糖生物学与分子诊断在肿瘤的发生发在肿瘤的发生发展过程中，蛋白展过程中，蛋白发生了发生了异常糖基异常糖基化化，导致糖蛋白，导致糖蛋白及其所在细胞的及其所在细胞的功能障碍，影响功能障碍，影响到肿瘤细胞与内到肿瘤细胞与内皮细胞的黏附、皮细胞的黏附、侵袭、转移，甚侵袭、转移，甚至出现恶性表型。至出现恶性表型。糖糖 类类 标标 记记 物物 肿瘤细胞内糖基化过程发生变异，从而导致细胞肿瘤细胞内糖基化过程发生变异，从而导致细胞分泌性或细胞膜上的糖蛋白或糖脂中的糖

25、基序列分泌性或细胞膜上的糖蛋白或糖脂中的糖基序列发生改变，形成了一种和正常糖蛋白不同的特殊发生改变，形成了一种和正常糖蛋白不同的特殊抗原，可利用单克隆抗体技术检测这些抗原，结抗原，可利用单克隆抗体技术检测这些抗原，结果诞生了糖蛋白类抗原果诞生了糖蛋白类抗原 作为新一代的肿瘤标记物，远较酶和激素类标记作为新一代的肿瘤标记物，远较酶和激素类标记物敏感、特异物敏感、特异不同肿瘤的常用检测指标和糖基化不同肿瘤的常用检测指标和糖基化癌症分类癌症分类常用检测指标常用检测指标糖基化糖基化肝癌肝癌AFP-L3岩藻糖基化岩藻糖基化胃癌胃癌CEA，CA50，CA199唾液酸化唾液酸化胰腺癌胰腺癌CEA，PCAA岩

26、藻糖基化，唾液酸化岩藻糖基化，唾液酸化乳腺癌乳腺癌CA153，CA125，CEA甘露糖化，唾液酸化甘露糖化，唾液酸化肺癌肺癌AFP CEA NSE岩藻糖基化，唾液酸化岩藻糖基化，唾液酸化肿瘤早期特异性糖基转移酶分类肿瘤早期特异性糖基转移酶分类半乳糖基转半乳糖基转移酶移酶岩藻糖基转岩藻糖基转移酶移酶唾液酸糖基唾液酸糖基转移酶转移酶N-乙酰氨基乙酰氨基葡萄糖转移葡萄糖转移酶酶N-乙酰氨基乙酰氨基半乳糖转移半乳糖转移酶酶-1,2肝癌肝癌 -1,4卵巢卵巢癌癌-1,3-1,4肺癌，肺癌，肝癌，胶质肝癌，胶质瘤瘤-1,2-1,3-1,4-1,6肝癌肝癌-1,3-1,3乳乳腺癌，肝癌，腺癌，肝癌，结肠癌结

27、肠癌-1,6-1,6乳乳腺癌，结肠腺癌，结肠癌癌-1,8-1,8GnT-1GnT-2GnT-3肝肝癌癌GnT-4GnT-5胰胰腺癌，乳腺腺癌，乳腺癌癌GnT-62,4,8,9,17,2,4,8,9,17,1818已确定与已确定与肿瘤相关肿瘤相关（共（共2020种）种）Glycans as cancer biomarkers1、A Glycomics Approach to the Discovery of Potential Cancer Biomarkersv糖组（Glycome）：是一个生物体或一个细胞中全部碳水化合物的集合，主要成分为糖缀合物（糖蛋白和糖脂等）的糖链部分，具有堪与基因组和

28、蛋白质组媲美的庞大信息含量。q 糖组学（Glycomics）：是从分析和破解一个生物或一个细胞全部糖链所含信息这一角度入手，研究糖链的分子结构、表达调控、功能多样性、以及与疾病之关系的科学。 The strategy for the release and isolation of glycans in the conditioned media of cell lines and human serum. Left pathway shows the release of O-linked glycan while right represents the N-linked glycan.R

29、epresentative MALDI-FTMS spectra (positive mode) of glycans found in the conditioned media of ovarian cell lines released using alkaline sodium borohydrate. The majority of the peaks come from fragments of N-glycans due to peeling reaction. Solid circle represents common glycans in all cell lines wh

30、ile open circle represents cell-line specific glycans.four ovarian cancer cell lines (Caov-3, OVCAR-3, ES-2, and SK-OV-3)Representative MALDI-FTMS spectra of (a) ovarian cancer patients and (b) normal individuals in the positivemode. Solid circles in (a) indicate glycans unique to ovarian cancer pat

31、ients while open circles in (b) correspond to glycans found in both normal and cancer patients.Total intensities of glycans labeled in Fig. a for each individual (24 healthy controls and 48 patients with ovarian cancer). The levels of glycans were increased in ovarian cancer.Receiver operating chara

32、cteristic (ROC) curves for all samples (48 ovarian cancer and 24 healthy control) using glycomics assay and CA125 value.The seven possible N-linked glycan biomarkers that are statistically significant (p 0.05). Glycan compositions are deduced from the accurate mass determined by MALDIFTICR MS2、18O L

33、abeling for a Quantitative Proteomic Analysis of Glycoproteins in Hepatocellular CarcinomaDifferential proteomic analysis by 18O labeling: Proteins identified only in lectin affinity enrichment. Panel of MS spectra and MS/MS spectra showing fold changes and peptide sequence identification from overe

34、xpressed proteins in HCC. Panels A, B, and C show the MS and MS/MS spectra of HTLNQIDEVK (fetuin), YALYDAS-FETK (destrin) and ADLSGITGAR (SERPINA1), respectively. The fold changes after lectin affinity enrichment is indicated in MS spectraGGYTLVSGYPK (hemopexin)TVDNFVALATGEK (peptidylprolyl isomeras

35、eTLMALGSLAVTK (transgelin) YALYDATYETK (cofilin 1),GLESTTLADK (CSRP 1) LSILYPATTGR (perox-iredoxin 6),ETFTTGLDAPR (tenascin C) QLSSGVSEIR (HSP 27-kDa),Validation of fetuin and cysteine-rich protein by Western blotting and immunohistochemicallabeling in tissues used for proteomic analysis. A The homo

36、genates from the tissue samples were resolved by SDS-PAGE and subsequently electroblotted onto nitrocellulose membrane and probed with specific antibodies as indicated. B Shows immunohistochemical labeling for fetuin and CSRP1, respectivelyMS/MS spectra of peptides from fibrinogen-like 2 and complem

37、ent component 4A analyzed using QToF. The spectra A and B show the N-glycosylation sites of the peptide LDGST*NFTR from fibrinogen-like 2 and GL*NVTLSSTGR from complement component 4A respectively (where *N indicates the N-glycosylation site modified by 18O). Spectrum shows the conversion of Asn to

38、Asp after PNGase F treatment3、Different array formats for glycosylation studiesExperimental strategy for the study of serum glycoproteins(A) Scanned images of printed standard glycoproteins. (B) Glycan distribution (xaxis). Levels are represented by fluorescence response on the y-axis.Glycoprotein m

39、icroarray proof-of-concept experiment utilizing glycoprotein standardsSample microarray image demonstrating quality of lectin responsePrincipal component analysis data illustrating similarity between samples usedApplications of antibody array platformsSchematic representation of two-color RCA on ant

40、ibody microarrays. Two pools of proteins are respectively labeled with digoxigenin (green triangle) and biotin (pink diamond). Primer 4.2-conjugated antidigoxigenin and primer 1-conjugated antibiotin bind to the captured proteins,followed by hybridization of circle 4.2 and circle 1. Polymerase exten

41、ds the primers using the circles as templates. Cy5-labeled oligonucleotides, complementary to the extended DNA from primer 4.2, and Cy3-labeled oligonucleotides, complementary to the extended DNA from primer 1,are then hybridized to the extended DNA strands, producing signal amplification in two col

42、ors.The detection of phosphorylation and glycosylation on antibody arrays. (a) Phosphorylated protein detection. Proteins are captured by antibody arrays and the arrays probed with biotinylated antiphosphotyrosine. Bound antibody is then detected using fluorescence from streptavidinphycoerythrin, wh

43、ich binds to biotin. (b) Two-color detection of glycans and proteins using digoxigenin-labeled proteins. Proteins are labeled with digoxigenin and captured on antibody arrays. The glycans on the proteins are detected with biotinylated lectins, which subsequently bind streptavidinphycoerythrin, and t

44、he protein levels detected using Cy5-labeled antidigoxigenin. (green, 543 nm). Fluorescence from the spots is shown in both color channels from the indicated antibodies.(c) Demonstration of glycan and protein detection on antibody arrays. Antibody arrays were incubated with no serum, unlabeled serum

45、 or digoxigenin-labeled serum. The arrays were then incubated with biotinylated SNA lectin, followed by detection with Cy5-labeled antidigoxigenin (red, 633 nm) and Cy3-labeled antibiotin (green, 543 nm). Fluorescence from the spots is shown in both color channels from the indicated antibodies.Schematic for Shotgun glycomics Glycans are released chemically or enzymatically from glycoproteins, GSLs are modified directly; the fluorescently labeled products are separated, quantified, and printed to create microarrays available for interrogation with GBPs.