飞行质谱仪检测样品的详细操作步骤.课件.ppt

1、 MALDI-TOF检测样品检测样品详细操作过程详细操作过程仪器名称：仪器名称： 基质辅助激光解吸电离基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪（简称飞行时间质谱仪（简称 MALDI-TOF） 仪器外观仪器外观1. 对生物大分子分子量的测定；对生物大分子分子量的测定；2. 对蛋白质进行高通量的鉴定对蛋白质进行高通量的鉴定(高纯度单一蛋白）；高纯度单一蛋白）；3. 对有机小分子化合物分子量的测定；对有机小分子化合物分子量的测定；4. 对寡核苷酸的分析；对寡核苷酸的分析；5. 对基因的单核苷酸多态性的分析。对基因的单核苷酸多态性的分析。广泛应用于蛋白质组学、基因组学、分子生物学研究广泛应用于蛋白质组学、

2、基因组学、分子生物学研究领域。领域。主要功能与应用主要功能与应用型号：型号：autoflex1、 线性模式飞行距离：线性模式飞行距离：1.22米；反射模式飞行距离：米；反射模式飞行距离：2.7米米2、 质量范围：可高达质量范围：可高达300,000道尔顿或更高道尔顿或更高3、 分辨率：分辨率： 线性模式：线性模式：ACTH18-39(m/z=2465.2)，激光打，激光打30次，分辨率次，分辨率4,000 反射模式：反射模式：Somatostatin (m/z=3147),，激光打，激光打30次，分辨率次，分辨率20,000 4、 灵敏度：灵敏度：1fmol ACTH18-39(m/z=246

3、5.2)，激光打，激光打20次次 线性模式线性模式 信噪比大于信噪比大于10：1； 反射模式反射模式 信噪比大于信噪比大于10：15、 质量准确度：质量准确度： 线性模式线性模式 质量准确度质量准确度 250 ppm。 反射模式反射模式 质量准确度质量准确度 60 ppm。主要性能指标主要性能指标（一）准备基质溶液（一）准备基质溶液（Matrix preparation protocol） （说明：根据样品类型选用合适的基质，此处的（说明：根据样品类型选用合适的基质，此处的HCCA适适于肽类和小分子蛋白）于肽类和小分子蛋白）1.Produce a saturated solution of H

4、CCA in (acetonitrile : 0.1%TFA, 1 : 2 v/v)2.Mix solution in ultra sonic device3.Spin down excess matrix in a centrifuge (5 min at 14000 RpM) and use the clear supernatant一、样品制备一、样品制备（二）（二） 手动点靶（手动点靶（Preparation onto MALDI TOF-Target） 干点法（干点法（Dried droplet method）：最为常用的一种方法）：最为常用的一种方法1.Mix equal volu

5、mes of sample with HCCA2.Apply 1ul onto the target 按图示模式点靶3.Dry at room temperature标标样样样样样样样样样样样样样样样样标标样样样样样样样样样样样样样样样样“自动点靶设备样品样品 “靶靶”（ MALDI TOF-Target）四、谱图解析四、谱图解析蛋白鉴定样品：进入下一步网上数据库检索蛋白鉴定样品：进入下一步网上数据库检索下面介绍：下面介绍： “肽指纹谱肽指纹谱”网上数据库检索网上数据库检索两种方法：两种方法：一、登陆一、登陆mascot网站，直接调用网站，直接调用.peaklist文件，进行检索。文件，进行检

6、索。二、用二、用biotools软件，打开样品的原始谱图，设定参数，重新软件，打开样品的原始谱图，设定参数，重新标峰，自动链接标峰，自动链接mascot网页，进行检索。将检索到的结果与网页，进行检索。将检索到的结果与原始谱图比对，检查峰匹配情况。原始谱图比对，检查峰匹配情况。此法可以省略步骤（三、此法可以省略步骤（三、标峰）标峰） 登陆网站登陆网站点击点击 第一种方法第一种方法设定各参数设定各参数调用调用 .peaklist 文件文件点击开始点击开始网上数据库检索结果网上数据库检索结果分值分值76的区域的区域根据样品来源确定目标蛋白根据样品来源确定目标蛋白点击选中的蛋白链接，则显示氨基酸序列等

7、详细信息点击选中的蛋白链接，则显示氨基酸序列等详细信息蛋白序列信息蛋白序列信息理论与检测值比较理论与检测值比较检索结果检索结果选中目标蛋白后，点击选中目标蛋白后，点击get hit(s)可通过谱图，直观地查看峰的匹配情况可通过谱图，直观地查看峰的匹配情况Get hit(s)后显示的页面后显示的页面五、校准样品谱图五、校准样品谱图 校准样品有四种：校准样品有四种：1、peptide calibration standard (1000Da - 4000Da) 简写为：简写为：pep_cal2、protein calibration standard (3000Da - 25000Da) 简写为：

8、简写为：pro _cal3、protein calibration standard (20000Da - 70000Da) 简写为：简写为：pro _cal4、oligonucleotide calibration standard (3000Da - 10000Da) 简写为：简写为：oligo_calpep_cal的谱图的谱图pro _cal的谱图的谱图pro _cal的谱图的谱图oligo_cal的谱图的谱图 以下几张谱图供大家参考。以下几张谱图供大家参考。六、举例六、举例肽谱干净无杂质，清晰易准确标峰，检索结果得分值高肽谱干净无杂质，清晰易准确标峰，检索结果得分值高肽谱干净无杂质，清

9、晰易准确标峰，检索结果得分值高肽谱干净无杂质，清晰易准确标峰，检索结果得分值高角蛋白污染严重角蛋白污染严重一组间隔均匀的峰，为质量较差的样品容器导致的污染，一组间隔均匀的峰，为质量较差的样品容器导致的污染，并严重抑制了样品的电离。并严重抑制了样品的电离。较脏的样品，检测不到肽峰较脏的样品，检测不到肽峰七、特别说明七、特别说明 就象就象DNA测序仪的检测结果好坏与模板、测序纯化测序仪的检测结果好坏与模板、测序纯化反应等有关一样，反应等有关一样，MALDI-TOF检测结果主要取决于样品检测结果主要取决于样品前期处理的好坏前期处理的好坏. 一方面质量较差的容器、溶剂和角蛋白污染等会导一方面质量较差的容器、溶剂和角蛋白污染等会导致谱图中含有大量的假样品峰致谱图中含有大量的假样品峰. 另一方面，样品中盐的存在会抑制样品的离子化，最另一方面，样品中盐的存在会抑制样品的离子化，最终导致检测不到样品峰，所以要严格操作过程，控制好终导致检测不到样品峰，所以要严格操作过程，控制好样品中的含盐量。样品中的含盐量。