特异性抗体制备技术课件.ppt

1、免疫原和抗血清制备技术免疫原和抗血清制备技术第一节第一节 免疫原的制备免疫原的制备第二节第二节 免疫血清的制备免疫血清的制备第三节第三节 抗体的纯化和鉴定抗体的纯化和鉴定 第一节第一节 免疫原的制备免疫原的制备一、细胞性抗原的制备一、细胞性抗原的制备二、可溶性抗原制备及鉴定二、可溶性抗原制备及鉴定三、半抗原免疫原的制备三、半抗原免疫原的制备四、佐剂四、佐剂 绵羊红细胞的制备流程图绵羊红细胞的制备流程图 摇动摇动15-20min15-20min 44可保存可保存3 3周周 取适量取适量 NSNS洗涤洗涤3 3次次2000r/min2000r/min 10min 10minNSNS稀释至稀释至 2

2、 25% 5% 细菌细胞抗原的制备流程图细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或液体培养或 斜面培养斜面培养 3724h3724h100100水浴水浴 2 22.5h2.5h 杀菌杀菌无菌试验无菌试验NSNS稀释成稀释成8 81010亿亿/ml/mlO O菌体抗原菌体抗原返回返回来源来源: : 组织和细胞，其成分比较复杂。组织和细胞，其成分比较复杂。 1.1.组织和细胞成分混合抗原制备组织和细胞成分混合抗原制备 2.2.蛋白质抗原制备蛋白质抗原制备 3.3.核酸抗原制备核酸抗原制备 4.4.类脂多糖抗原制备类脂多糖抗原制备 5.5.免疫球蛋白片段制备免疫球蛋白片段制备 6.6.纯化抗原的鉴定纯化抗原

3、的鉴定 二、可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原可溶性抗原: :蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、 补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸返回返回 组织和细胞成分混合抗原制备程序组织和细胞成分混合抗原制备程序上清液上清液澄清澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包去除包膜或结膜或结缔组织缔组织脏器进行灌洗脏器进行灌洗洗去血迹洗去血迹及污物及污物NSNS内含内含0.5g0.5gL NaNL NaN2 2冷浴中组织剪碎冷浴中组织剪碎装入捣碎机简内高速装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液粉碎制成组织匀浆液30

4、00r3000rminmin10min10min取上清液取上清液去除细胞碎片去除细胞碎片及微小组织及微小组织离心离心 细胞破碎技术及评价细胞破碎技术及评价1.1.酶处理法酶处理法2.2.冻融法冻融法3.3.超声破碎法超声破碎法4.4.表面活性剂处理表面活性剂处理 常用酶类：常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 1.1.酶酶处理法处理法 方法：方法：在一定的条件下，能消化细菌和在一定的条件下，能消化细菌和 组织细胞。组织细胞。 特点：特点：此法适用多种微生物；此法适用多种微生物； 具有作用条件温和；具有作用条件温和； 内含物成分不易受到破坏；内含物成分不易受到破坏； 细

5、胞壁损坏的程度可以控制。细胞壁损坏的程度可以控制。 2.2.冻融法冻融法 原理：原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。完完 方法：方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然 后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织 细胞及细胞内的颗粒可被融破。细胞及细胞内的颗粒可被融破。 特点：特点：此法适用于组织细胞，对微生物细此法适用于组织细胞，对微生物细 胞作用较差。胞作用较差。 3.3.超声破碎法超声破碎法原理：原理：利用超声波的机械振动而使细胞

6、破碎。利用超声波的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生空化作用由于超声波发生空化作用（cavitationcavitation）使得使得液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波使用的频率从碎。超声波使用的频率从1kHz1kHz20kHz20kHz不等，间不等，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。特点：特点：操作简单，重复性较好，节省时间；操作简单，重复性较好，节省时间； 多用于微生物和组织细胞的破碎。多用于微生物和组织细

7、胞的破碎。 4.4.表面活性剂处理表面活性剂处理 原理：原理：在适当的温度、在适当的温度、pHpH及低离子强度的条及低离子强度的条 件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡， 使膜的渗透性改变或使之溶解。使膜的渗透性改变或使之溶解。 常用的有：常用的有：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS,(SDS,阴离子型阴离子型) )、 二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯 （非离子型）、新洁尔灭等。（非离子型）、新洁尔灭等。 应用：应用：破碎细菌，且作用比较温和；破碎细菌，且作用比较温和； 提取核酸时，常用此法破碎细胞。提取核酸时，常

8、用此法破碎细胞。 蛋白质抗原制备蛋白质抗原制备 蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高 的抗血清通常需要纯化。可采用：的抗血清通常需要纯化。可采用： 1.1.超速离心法超速离心法 2.2.选择性沉淀法选择性沉淀法 3.3.凝胶层析法凝胶层析法 4.4.离子交换层析法离子交换层析法 5.5.亲合层析法亲合层析法 1 1超速离心法超速离心法 原理原理: :利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同， 使具有不同沉降速度的颗粒使具有不同沉降速度的颗粒, ,处于不同密度处于不同密度 的梯度层内，达到彼此分离的目的。的梯度层内，达到彼此分离的目的。

9、特点：特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗用超速离心或梯度密度离心法纯化抗 原，极难将某一抗原成分分离出来。原，极难将某一抗原成分分离出来。 应用：应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻用于少部分大分子抗原和一些比较轻 的抗原物质的分离，如的抗原物质的分离，如IgMIgM、C1qC1q、甲状腺球、甲状腺球 蛋白、载脂蛋白蛋白、载脂蛋白A A、B B等。等。 2 2、选择性沉淀法、选择性沉淀法 原理：原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用根据各蛋白质理化特性的差异，采用 各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原 成分沉淀，从而达到纯化的目的。成分沉淀，从而达

10、到纯化的目的。 常用方法：常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解 度不同）；常用度不同）；常用33335050饱和度的硫酸胺。饱和度的硫酸胺。 特点：特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。 应用：应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。在大量制备中先用此法粗提，再纯化。 3 3凝胶层析法（凝胶过滤法）凝胶层析法（凝胶过滤法）原理：原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质， 经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种 分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分分子大

11、小不一的混合物加在凝胶床面时，大分 子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝 胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时 间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝 胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分 成大、中、小三种类型。成大、中、小三种类型。 4 4离子交换层析法离子交换层析法 原理：原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋

12、白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位素上的电荷位 置，从而使血清中的蛋白质分成置，从而使血清中的蛋白质分成球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋白等几个部球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。 5 5亲和层析法（亲和色谱）亲和层析法（亲和色谱）原理：原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离依据抗原抗体的生物学活性进行

13、分离和提纯的技术。将纯化的抗和提纯的技术。将纯化的抗IgGIgG附着于惰性的附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的过此柱时，待分离的IgGIgG可选择性地与免疫吸可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体附剂上的特异性配体( (抗抗IgG)IgG)结合；当改变洗结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的脱条件可重新解离，将待分离的IgIg洗脱下来，洗脱下来，达到纯化的目的。达到纯化的目的。优点：优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。提取纯度高、抗原抗体不失活性。正常细胞正常细胞 标记细胞标记细胞洗滴洗滴标记细胞标记细胞被酶裂解被酶

14、裂解加入特异加入特异性抗体性抗体其它蛋白其它蛋白洗涤流失洗涤流失SDS-PAGESDS-PAGE分离蛋白分离蛋白 亲和层析法示意图亲和层析法示意图 核酸抗原制备核酸抗原制备大分子的核酸具有免疫原性。大分子的核酸具有免疫原性。提取核酸的主要步骤：提取核酸的主要步骤：破碎细胞破碎细胞核酸从细胞中游离出来核酸从细胞中游离出来酸沉淀核酸沉淀核除去蛋白质除去蛋白质乙醇乙醇酚和氯仿酚和氯仿 类脂多糖抗原制备类脂多糖抗原制备苯酚法提取苯酚法提取LPSLPS：干燥菌体干燥菌体或湿菌体或湿菌体水中水中混匀混匀激烈搅匀激烈搅匀加热加热5min5min冰水冰水急冷急冷降至降至1010以下以下离心离心上层的水层上层的

15、水层( (含含LPS)LPS)下层的酚层下层的酚层菌体残渣于底部菌体残渣于底部吸取吸取水层水层透析透析除酚除酚加热加热超速离心超速离心浓缩浓缩LPS LPS 在上层在上层沉淀的透明沉淀的透明胶状部内胶状部内绞出绞出悬于水中悬于水中离心离心得纯化得纯化LPSLPS同温的苯酚同温的苯酚 免疫球蛋白片段制备免疫球蛋白片段制备1 1酶裂解法酶裂解法 酶对免疫球蛋白的水解有极好酶对免疫球蛋白的水解有极好 的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解 为不同的片段。为不同的片段。2 2氧化法和还原法氧化法和还原法 是将免疫球蛋白轻、重是将免疫球蛋白轻、重 链分开的两种常用方法。

16、链分开的两种常用方法。3. 3. 还可用还可用强变性剂强变性剂或利用或利用改变改变pHpH将免疫球蛋将免疫球蛋 白亚单位分开。白亚单位分开。 酶水解免疫球蛋白示意图酶水解免疫球蛋白示意图FcFc段，用段，用以制备抗以制备抗重链血清重链血清F(ab)F(ab)2 2，常作为抗常作为抗体试剂用体试剂用于试验于试验木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶（papain)papain)胰蛋白酶胰蛋白酶(pepsin)(pepsin)胃蛋白酶胃蛋白酶(pepsin)(pepsin)1. 1. 氧化法：氧化法：优点是切开后，肽链不能重新优点是切开后，肽链不能重新 形成二硫键、便于肽链纯化；形成二硫键、便于肽链纯化； 缺点是色

17、氨酸侧链容易被破坏。缺点是色氨酸侧链容易被破坏。 氧化法和氧化法和还原法评价还原法评价返回返回2. 2. 还原法：还原法：将二硫键还原成琉基。但极不将二硫键还原成琉基。但极不 稳定，易重新形成二硫键，必须及时用稳定，易重新形成二硫键，必须及时用 碘乙酸或碘化酰胺进行羧甲基化。碘乙酸或碘化酰胺进行羧甲基化。 纯化抗原的鉴定纯化抗原的鉴定1.1.含量鉴定含量鉴定 2.2.理化性质鉴定理化性质鉴定 凝胶层析技术测定凝胶层析技术测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶管状电泳凝胶管状电泳 超速离心超速离心3.3.纯度鉴定纯度鉴定 常用醋酸纤维膜电泳常用醋酸纤维膜电泳 4.4.免疫活性鉴定免疫活

18、性鉴定 常用双向琼脂扩散试验常用双向琼脂扩散试验蓝色蓝色 1 1含量鉴定含量鉴定在一定范围内，颜色深浅与蛋白质浓度呈直线相关。在一定范围内，颜色深浅与蛋白质浓度呈直线相关。方法：酚试剂法鉴定方法：酚试剂法鉴定主要试剂：磷钼酸主要试剂：磷钼酸- -钨酸的混合酸钨酸的混合酸原理：原理：蛋白质中的酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸等能蛋白质中的酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸等能钨酸、钼酸钨酸、钼酸还原还原3H3H2 2OPOP2 20 05 513WO13WO3 35MoO5MoO3 3110H0H2 20 0和和3H3H2 2P P2 20 05 514WO14WO3 34MoO4MoO3 31010H H2 2

19、0 0络合物的双缩脲法络合物的双缩脲法蛋白质蛋白质CaCa2+2+碱性碱性加深加深蓝色蓝色已知分子量的标准品已知分子量的标准品 测未知分子量：测未知分子量：将样品在同一凝胶柱上，同一条将样品在同一凝胶柱上，同一条 件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。 此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。凝胶柱凝胶柱保留体积保留体积分子量的对数分子量的对数 2. 2.理化性质鉴定理化性质鉴定绘制标准曲线绘制标准曲线凝胶层析技术进行测定凝胶层析技术进行测定垂直电泳垂直电泳聚合成大分子凝胶聚合成大分子凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳

20、（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE） 有分子筛效应、电荷效应及浓缩效应，能精有分子筛效应、电荷效应及浓缩效应，能精 确地分离和鉴定高分子物质。确地分离和鉴定高分子物质。 PAG PAG的分子筛效应测定蛋白质抗原的分子量。的分子筛效应测定蛋白质抗原的分子量。 原理：原理： 双丙烯酰胺双丙烯酰胺N,N-methylene N,N-methylene bisacrylamide,Bisbisacrylamide,Bis 丙烯酰胺丙烯酰胺(acrylamide,Acr)(acrylamide,Acr)催化剂催化剂 3. 3. 纯度鉴定纯度鉴定 方法：方法：醋酸纤维膜电泳进行鉴定。醋酸纤维膜电泳进行

21、鉴定。返回返回 原理：原理：蛋白质在一定蛋白质在一定pHpH下都带有电荷，由于下都带有电荷，由于 各种蛋白质等电点不同、分子量也异，因此各种蛋白质等电点不同、分子量也异，因此 所带电量也各不相同，在外加直流电场的作所带电量也各不相同，在外加直流电场的作 用下，它们泳动的速度不同，经一段时间后用下，它们泳动的速度不同，经一段时间后 即可彼此分开，形成电泳谱；从而判断蛋白即可彼此分开，形成电泳谱；从而判断蛋白 质抗原的纯度。质抗原的纯度。 特点：特点：快速简便。快速简便。 三、半抗原免疫原的制备1.1.半抗原：半抗原：低分子量的化学物质。例如多糖、低分子量的化学物质。例如多糖、 多肽、甾族激素、脂

22、肪胺、类脂质、核苷、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、 某些药物某些药物( (包括抗生素）及其他化学物品等。包括抗生素）及其他化学物品等。2.2.载体：载体：蛋白质类蛋白质类 多肽聚合物多肽聚合物 大分子聚合物大分子聚合物3.3.半抗原半抗原- -载体连接方法载体连接方法: : 载体类型载体类型 1.1.蛋白质：蛋白质：人血清白蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白牛血清白蛋白、兔、兔 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。2.2.多肽聚合物：多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万氨酸，其分子量大（可达十几万到

23、几十万) )， 这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动 物产生高效价、高亲和力的抗体。物产生高效价、高亲和力的抗体。3.3.大聚合物：大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦 可诱发动物产生抗体。可诱发动物产生抗体。 半抗原半抗原- -载体连接方法载体连接方法1 1碳化二亚胺法：碳化二亚胺法：R-NH=CH-RR-NH=CH-R半抗原载体蛋白质半抗原载体蛋白质搅拌搅拌1 12h2h室温室温2424h h透吸除去未反透吸除去未反应的半抗原应的半抗原人工免疫

24、原人工免疫原混合混合混合混合 半抗原半抗原- -载体连接方法载体连接方法2 2戊二醛法戊二醛法: :半抗原半抗原-NH-NH2 2载体蛋白载体蛋白-NH-NH2 2半抗原半抗原-N=-N=CH-(CHCH-(CH2 2) )3 3-CH=-CH=NH-NH-载体蛋白载体蛋白OHC-(CHOHC-(CH2 2) )3 3-CHO-CHO* *戊二醛是常用的带有两个活性基团的双戊二醛是常用的带有两个活性基团的双 功能联接剂功能联接剂 半抗原半抗原- -载体连接方法载体连接方法3 3氯甲酸异丁脂法：氯甲酸异丁脂法：半抗原半抗原-COOH-COOH载体蛋白载体蛋白-NH-NH2 2Cl-COO-CHC

25、l-COO-CH2 2CH(CHCH(CH3 3) )2 2半抗原半抗原-COO-COO-CH-COO-COO-CH2 2CH(CHCH(CH3 3) )2 2半抗原半抗原-CO-CO-NHNH- -载体蛋白载体蛋白简便，用于类固醇抗原制备简便，用于类固醇抗原制备HO-HO-CHCH2 2CH(CHCH(CH3 3) )2 2 半抗原半抗原- -载体连接方法载体连接方法4 4琥珀酸酐法：琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备用于不含羧基衍生物半抗原制备半抗原半抗原-CH-CH2 2OHOHCHCH2 2-CO -CO CHCH2 2-CO -CO 带羧基的半抗原带羧基的半抗原琥珀酸衍生物琥珀

26、酸衍生物半抗原半抗原-CH-CH2 2-OOC-CH-OOC-CH2 2-CH-CH2 2-COOH-COOH返回返回吡啶吡啶再经氯甲酸异丁脂法或碳化再经氯甲酸异丁脂法或碳化二亚胺法制备载体半抗原二亚胺法制备载体半抗原 四、佐剂* * 概念：概念：与抗原同时或预先注射于机体，能增与抗原同时或预先注射于机体，能增 加机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。加机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。 条件：条件：增加抗原的表面积；增加抗原的表面积； 改变抗原的活性基团构型；改变抗原的活性基团构型； 佐剂与抗原混合能延长抗原在局部佐剂与抗原混合能延长抗原在局部 组织的存留时间；组织的存留时间； 可直接或

27、间接激活免疫活性细胞；可直接或间接激活免疫活性细胞； 无毒性或无副作用。无毒性或无副作用。 （二）常用佐剂的种类和制备（二）常用佐剂的种类和制备1.1.氢氧化铝佐剂：氢氧化铝佐剂：5%5%硫酸铝硫酸铝5%5%氢氧化钠氢氧化钠氢氧化氢氧化铝沉淀铝沉淀制成悬液制成悬液即为佐剂即为佐剂强烈搅拌强烈搅拌NSNS洗洗二次二次NSNS等体积抗原等体积抗原免疫接种免疫接种 2.2.明矾佐剂明矾佐剂10%10%硫酸钾铝硫酸钾铝氢氧化钠校正氢氧化钠校正pHpH值至值至6.56.5沉淀沉淀乳状悬液乳状悬液* * 明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射，皮下注射明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射，皮下注射 易引起肉芽种和脓肿。易引

28、起肉芽种和脓肿。NSNS搅拌搅拌NSNS洗洗二次二次离心离心抗原抗原备用备用防腐剂防腐剂作用大于不完全佐剂作用大于不完全佐剂局部形成肉芽种和溃疡局部形成肉芽种和溃疡不能用于人体不能用于人体弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂 3. 3.弗氏佐剂弗氏佐剂(Freund adjuvant)(Freund adjuvant)液体石蜡液体石蜡完全完全乳化乳化备用备用高压高压灭菌灭菌加热加热抗原抗原弗氏不完全佐剂弗氏不完全佐剂卡介苗卡介苗羊毛脂羊毛脂鉴定鉴定一滴一滴乳剂乳剂乳剂不散乳剂不散浮于液面浮于液面水中水中混合混合 4.4.佐剂应用原则和评价佐剂应用原则和评价目的目的: :增强抗原对机体的免疫原性；增强抗原对

29、机体的免疫原性； 增强抗体的产生能力；增强抗体的产生能力； 为制备出高效价的免疫血清；为制备出高效价的免疫血清； 增强可溶性抗原的免疫原性；增强可溶性抗原的免疫原性； 在某种情况下，改变在某种情况下，改变AgAg免疫应答类型；免疫应答类型； 延长抗原在免疫动物的时间；延长抗原在免疫动物的时间； 改变抗原的分布；改变抗原的分布； 增强局部对变应原的超敏反情况；增强局部对变应原的超敏反情况； 应用佐剂的缺点应用佐剂的缺点 佐剂常混有微量其它物质，这些物质进佐剂常混有微量其它物质，这些物质进 入体内后也可引起抗体的产主，影响抗入体内后也可引起抗体的产主，影响抗 血清的特异性；血清的特异性； 注射佐剂

30、可引起局部形成肉芽肿和无菌注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌 性脓肿；性脓肿； 反复注射，易发生超敏反应，使局部组反复注射，易发生超敏反应，使局部组 织坏死，甚至引起动物死亡。织坏死，甚至引起动物死亡。 第二节第二节 免疫血清的制备免疫血清的制备1.1.免疫动物选择免疫动物选择2.2.免疫方法免疫方法3.3.动物采血法动物采血法4.4.免疫血清的分离及保存免疫血清的分离及保存 一、免疫动物选择一、免疫动物选择 能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。 兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。 1. 1.抗原与免疫动物种属差异越远越好；

31、抗原与免疫动物种属差异越远越好； 2. 2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、 体重合乎要求；体重合乎要求； 3.3.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫 应答；应答； 4.4.按需要量选择大小不同的动物。按需要量选择大小不同的动物。 二、免疫方法 3. 3.免疫方案免疫方案 全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射 微量免疫法：卡介苗微量免疫法：卡介苗7 7天天弗氏佐剂弗氏佐剂1 1月月 抗原抗原 混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉 1.1.免疫原的注射剂量

32、免疫原的注射剂量 2.2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉 腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌 三、动物采血法三、动物采血法1.1.颈动脉放血法：最常用的方法颈动脉放血法：最常用的方法2.2.心脏采血法：要求操作熟练心脏采血法：要求操作熟练3.3.静脉采血法：静脉采血法：1.41.4保存：可保存保存：可保存3 36 6个月个月2.2.低温保存：低温保存：-20-20-40-40，可保存，可保存2 23 3年年3.3.冰冻干燥保存：可保存冰冻干燥保存：可保存3 35 5年年 第三节第三节 抗体的纯化和鉴定抗体的纯化和鉴定1.1.抗体特异性

33、的纯化抗体特异性的纯化2.2.特异性特异性IgGIgG类抗体的纯化类抗体的纯化3.3.特异性抗体的鉴定特异性抗体的鉴定 一、抗体特异性的纯化一、抗体特异性的纯化 1.1.亲合层析法：亲合层析法：将交叉抗原交联到将交叉抗原交联到SepharoseSepharose 4B 4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层 析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异 性抗体。性抗体。2.2.吸附法：吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直利用不含特异性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合

34、，上 清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。 二、特异性二、特异性IgGIgG类抗体的纯化类抗体的纯化1.1.盐吸沉淀法：盐吸沉淀法：经硫酸铵盐吸提取经硫酸铵盐吸提取球蛋白球蛋白 3 3次，基本为次，基本为IgGIgG类抗体，但不纯。类抗体，但不纯。2.A2.A蛋白亲和层析：蛋白亲和层析：SPASPA与与IgGIgG的的FcFc段有很强的段有很强的 特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地 与抗体结合，一个与抗体结合，一个A A蛋白至少可以结合二个蛋白至少可以结合二个 IgGIgG分子。适合纯化细胞培养上清中的分子。适合纯化细胞

35、培养上清中的McAbMcAb。3.3.其它：其它：凝胶过滤、离子交换层析等凝胶过滤、离子交换层析等 三、特异性抗体的鉴定三、特异性抗体的鉴定 1. 1.抗体效价的鉴定：抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定即为抗体活性滴定 2. 2.抗体特异性鉴定：抗体特异性鉴定： 细菌类抗原的抗体用凝集试验细菌类抗原的抗体用凝集试验 可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验 3. 3.抗体的纯度鉴定：抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法免疫电泳分析法 4. 4.抗体亲和力鉴定：抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好亲和力高则灵敏度好 第四节第四节 单克隆抗体技术单克隆抗体技术单克隆抗体：单克隆抗

36、体：由由B B细胞杂交瘤产生的只识别抗原细胞杂交瘤产生的只识别抗原 分子上一种抗原决定簇的抗体分子。分子上一种抗原决定簇的抗体分子。多克隆抗体：多克隆抗体：识别抗原分子上各种抗原决定簇识别抗原分子上各种抗原决定簇 的多种抗体的混合制剂。的多种抗体的混合制剂。一、杂交瘤技术的原理及流程一、杂交瘤技术的原理及流程二、单克隆抗体的应用二、单克隆抗体的应用返回返回 一、一、杂交瘤技术的原理及流程杂交瘤技术的原理及流程 二、单克隆抗体的应用二、单克隆抗体的应用1.1.医学检验试剂：医学检验试剂： 传染病的快速诊断传染病的快速诊断 寻找寻找TSATSA及检测及检测TAATAA 免疫细胞抗原检测免疫细胞抗原检测 激素测定激素测定 血中药物浓度监测血中药物浓度监测 HLAHLA分型监测分型监测2.2.导向治疗作用导向治疗作用3.3.抗原物质的分离和提纯抗原物质的分离和提纯