第十三讲-蛋白质分子设计课件.ppt

1、第十三讲 蛋白质分子设计（二）概述概述部分氨基酸突变部分氨基酸突变第三节第三节 天然蛋白质的剪裁天然蛋白质的剪裁天然蛋白质的天然蛋白质的剪裁剪裁“中改中改”，是指在蛋白质中替换，是指在蛋白质中替换1个肽段个肽段或者或者1个结构域个结构域的分子操作技术。的分子操作技术。 蛋白质的蛋白质的立体结构立体结构可以看作由可以看作由结构元件结构元件组装而成的，因此组装而成的，因此 将不同蛋白质之间将不同蛋白质之间结构元件结构元件成段地成段地替换替换 期望能够转移相应的功能。期望能够转移相应的功能。“中改中改”操作，在操作，在新型抗体新型抗体的开发中已有广泛应用的开发中已有广泛应用。谈谈2个问题：一是个问题

2、：一是抗体剪裁抗体剪裁，二是蛋白质，二是蛋白质关键残基嫁接关键残基嫁接 一、抗体剪裁一、抗体剪裁 抗体的基本结构抗体的基本结构：四链结构：四链结构 四肽链：由四肽链：由2条重链（条重链（H链），链），2条轻链（条轻链（L链）组成；链）组成； 结构域：结构域：IgG H链链4个，个，L链链2个；个； 抗体识别位点组成抗体识别位点组成：由轻、重二链：由轻、重二链1个结构域的个结构域的高可变区高可变区共同构成共同构成。 抗原抗原决定子互补区决定子互补区：抗体分子可变区的一些环状肽段组成的。：抗体分子可变区的一些环状肽段组成的。抗原表位抗原表位抗体识别位点抗体识别位点 一、抗体剪裁一、抗体剪裁 人人鼠

3、嵌合抗体的制备鼠嵌合抗体的制备（思路）（思路） 利用分子剪裁技术对抗体分子进行剪裁的成功实例利用分子剪裁技术对抗体分子进行剪裁的成功实例实验英国剑桥大学的实验英国剑桥大学的Winter等。等。 将小鼠单抗的将小鼠单抗的V区区，换到人抗体分子的，换到人抗体分子的相应部位相应部位上，上， 使小鼠单抗所具备的使小鼠单抗所具备的抗原结合专一性抗原结合专一性转移到人的抗体分子上。转移到人的抗体分子上。 单克隆抗体（单抗，单克隆抗体（单抗，McAb）？）？ 抗体剪裁的抗体剪裁的医学价值医学价值u 与人与人McAb相比，小鼠相比，小鼠McAb容易制备，容易制备， 抗原性强，但易导致人体过敏反应。抗原性强，但

4、易导致人体过敏反应。u 将鼠将鼠McAb抗原结合部位转移到人抗体抗原结合部位转移到人抗体上，上，u 达到与人达到与人McAb同样的效果。同样的效果。抗体剪裁抗体剪裁1、 抗体的人源化抗体的人源化新的挑战：新的挑战： 改造改造鼠源鼠源McAb基因基因，综合综合人人鼠嵌合鼠嵌合McAb的优点的优点； 获得获得特异性高、异源性小特异性高、异源性小的，具有临床应用价值的抗体。的，具有临床应用价值的抗体。为何要人源化？为何要人源化？ 相对于相对于“人人”杂交瘤细胞系统杂交瘤细胞系统，“鼠鼠”杂交瘤细胞生长快，杂交瘤细胞生长快，产生抗体量产生抗体量大大。 鼠鼠McAb用于人体，用于人体，免疫原性免疫原性和

5、相对和相对缺乏恒定区缺乏恒定区依赖的依赖的功能效应功能效应，使它的，使它的应用受到了一定的限制。应用受到了一定的限制。改造的必要性：改造的必要性： 对对鼠源鼠源McAb进行蛋白质工程改造，进行蛋白质工程改造，合成人源化单抗合成人源化单抗。Ab的作用（补充）：的作用（补充）：识别作用：特异性与抗原分子结合识别作用：特异性与抗原分子结合生物效应：调理作用、免疫粘联、激活补体生物效应：调理作用、免疫粘联、激活补体（1）鼠单克隆抗体）鼠单克隆抗体恒定区恒定区的人源化的人源化 将小鼠将小鼠McAb恒定区恒定区用人抗体恒定区用人抗体恒定区代替代替而拼接成嵌合抗体，既而拼接成嵌合抗体，既具有具有抗原结合特异

6、性抗原结合特异性，又极大地降低了鼠单克隆抗体的，又极大地降低了鼠单克隆抗体的异源性异源性。u改造策略和程序：改造策略和程序： 克隆鼠克隆鼠McAb可变区基因可变区基因从从鼠鼠杂交瘤杂交瘤 提取提取mRNA可变区基因可变区基因cDNA文库文库 表达载体表达载体抗原特异性筛选抗原特异性筛选可变区基因可变区基因； 选择合适的选择合适的人恒定区人恒定区基因；基因； 恒定区基因比较保守，恒定区基因比较保守，易于克隆易于克隆获得获得 重组重组载体的载体的构建与表达构建与表达 抗体分子的糖基化和可变区的折叠、链内二硫键形成，抗体分子的糖基化和可变区的折叠、链内二硫键形成， 以及重链和轻链相互作用形成正确的以

7、及重链和轻链相互作用形成正确的立体构象立体构象。 常用常用哺乳类细胞哺乳类细胞表达系统表达系统CH3MouseHumanChimericCH3VHCH1VLCLCH2HCLC（2）人改型抗体（）人改型抗体（互补决定区移植互补决定区移植） l问题提出：问题提出：u人源化人源化嵌合抗体嵌合抗体的的可变区可变区仍具有仍具有抗原性抗原性。能诱发人产生抗小鼠抗体，导。能诱发人产生抗小鼠抗体，导致过敏反应，需对人源化抗体的致过敏反应，需对人源化抗体的可变区可变区再进行改造。再进行改造。l抗体抗体可变区组成：可变区组成：u互补决定区互补决定区（CDR）和）和骨架区骨架区 组成。组成。 CDR：识别抗原表位的

8、区域，直接：识别抗原表位的区域，直接决定了抗体的特异性决定了抗体的特异性；骨架区骨架区 维持维持CDR构象构象u骨架区序列骨架区序列及其立体结构较为及其立体结构较为保守保守，是，是嵌合抗体嵌合抗体诱导诱导人抗小鼠抗体人抗小鼠抗体的主的主要原因；要原因；u将将鼠鼠McAb CDR移植到移植到人人McAb的可变区的的可变区的骨架骨架上，使人上，使人McAb获得鼠获得鼠McAb结合特异性，进一步减少异源性。结合特异性，进一步减少异源性。l互补决定区移植的设计互补决定区移植的设计u简单简单地将地将CDR序列序列移植移植到人源抗体中，甚至完全丧失亲和力。到人源抗体中，甚至完全丧失亲和力。u必须进行必须进

9、行互补决定区序列互补决定区序列与与框架结构框架结构的的移植设计移植设计。l移植设计的原则移植设计的原则将将CDR序列序列和和紧邻两侧的骨架紧邻两侧的骨架序列序列一起移植一起移植；对对骨架区骨架区中影响中影响抗原结合部位抗原结合部位的的aa残基残基改为改为鼠源鼠源McAb的残基的残基；人人McAb可变区序列可变区序列的选择：抗体的选择：抗体可变区可变区序列序列数据库分析数据库分析，选择选择与鼠与鼠单克隆抗体单克隆抗体同源性高同源性高的的人源序列人源序列；保留保留可变区可变区N末端末端aa序列序列，尤其是，尤其是轻链轻链可变区可变区N末端末端序列。序列。将将人改型可变区人改型可变区基因与基因与人人

10、lg恒定区恒定区基因连接，构成基因连接，构成完整的人改型完整的人改型基因基因进行表达。进行表达。2、抗体的小分子化改造、抗体的小分子化改造l小分子抗体小分子抗体？能与能与抗原结合抗原结合的抗体小分子的抗体小分子V区区片段片段称称，具识别活性具识别活性 主要包括主要包括4类类 Fab抗体：抗体：酶水解法：酶水解法：用用木瓜水解酶木瓜水解酶消化抗体可获得消化抗体可获得2个个Fab片段片段。2条肽链条肽链基因工程方法：基因工程方法：在在Fab基因基因表达表达Fab片段片段的功能。的功能。H链和链和L链基因分别构建，在链基因分别构建，在2个载体上，个载体上，共转染细胞，或者构建在一个载体上转染细胞进行

11、表达。共转染细胞，或者构建在一个载体上转染细胞进行表达。 Fv抗体抗体：Fv是由是由轻链和重链可变区轻链和重链可变区组成的组成的单价小分子单价小分子，是与抗原结合的，是与抗原结合的最小功最小功能片段能片段。 2条肽链条肽链分别构建分别构建含含H和和L可变区可变区基因基因的载体，共转染细胞，使之各自表达后组装成功能性的载体，共转染细胞，使之各自表达后组装成功能性Fv分子；或分子；或在一个载体中在一个载体中H可变区和可变区和L可变区基因可变区基因之间设置之间设置终止密码子终止密码子，分别表达，分别表达2个小分子片段。个小分子片段。 单链单链抗体抗体（ScFv）：）：将轻链和重链的可变区连接起来的抗

12、体将轻链和重链的可变区连接起来的抗体。1条肽链条肽链l单价抗体的特点：单价抗体的特点：优点：分子量小，优点：分子量小，免疫原性弱免疫原性弱、渗透力强，并可用于药物导向、中和毒素等功能。、渗透力强，并可用于药物导向、中和毒素等功能。缺点：缺点：无抗体无抗体C区区，不能介导抗体的其他，不能介导抗体的其他生物学效应生物学效应。双价抗体片段双价抗体片段：利用利用构建构建双价双价单特异性单特异性抗体抗体和和双价双价多特异性多特异性抗体抗体。 3、双特异性抗体、双特异性抗体（完整抗体）（完整抗体）u 双特异性抗体双特异性抗体( BsAb)？也称？也称双功能抗体双功能抗体或或杂交抗体杂交抗体，为，为。2个抗

13、原结合部位，具有个抗原结合部位，具有不同的不同的特异性特异性化学化学结构上结构上是双价的，结合抗原的是双价的，结合抗原的功能上功能上是单价的；是单价的；不同于天然抗体（在化学不同于天然抗体（在化学结构及功能结构及功能上均是双价的）上均是双价的）BsAb具有双特异性，能交联具有双特异性，能交联2种抗原，可介导种抗原，可介导标记物标记物与与靶抗原靶抗原结合（造影）。结合（造影）。u双特异性抗体制备方法双特异性抗体制备方法化学交联化学交联双特异性抗体：制备单价抗体，双功能交联剂交联。双特异性抗体：制备单价抗体，双功能交联剂交联。细胞工程细胞工程双特异性抗体：通过双特异性抗体：通过细胞融合细胞融合的方

14、法制备双特异性抗体。可将分泌的方法制备双特异性抗体。可将分泌单抗的杂交瘤与经免疫的脾细胞融合，或使两种分泌不同特异性单抗的杂交单抗的杂交瘤与经免疫的脾细胞融合，或使两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤彼此融合。瘤彼此融合。基因工程基因工程双特异性抗体：体外组装表达分泌型的双特异性抗体。双特异性抗体：体外组装表达分泌型的双特异性抗体。药物药物靶细胞靶细胞 4 4、基因工程抗体、基因工程抗体基因的表达基因的表达l概述：概述：蛋白质的表达系统有很多，其中主要包括蛋白质的表达系统有很多，其中主要包括大肠大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物类细胞、杆菌、酵母菌、哺乳动物类细胞、昆虫昆虫细胞及细胞及植物细胞植物细胞等表达

15、系统。等表达系统。抗体分子表达：常用抗体分子表达：常用大肠大肠杆菌和杆菌和哺乳哺乳类细胞。类细胞。l大肠杆菌大肠杆菌：原核细胞表达系统。：原核细胞表达系统。成熟成熟的基因克隆、蛋白表达体系，具有繁殖迅速、易于操作控制等优点。的基因克隆、蛋白表达体系，具有繁殖迅速、易于操作控制等优点。缺乏蛋白质缺乏蛋白质加工系统加工系统，内源性蛋白酶易降解外源蛋白，内源性蛋白酶易降解外源蛋白，内毒素导致内毒素导致人体人体热源热源反应反应仅可用于仅可用于表达抗体片段表达抗体片段，如单链抗体等。，如单链抗体等。难以表达完成的抗体难以表达完成的抗体l哺乳类细胞哺乳类细胞：真核细胞表达体系，：真核细胞表达体系，可完成可

16、完成正确正确的蛋白质的蛋白质修饰和装配修饰和装配，更接近天然抗体更接近天然抗体，具有正常的，具有正常的生物活性生物活性；缺点是成本高，操作相对烦琐。缺点是成本高，操作相对烦琐。 二、蛋白质关键残基嫁接二、蛋白质关键残基嫁接蛋白质之间相互作用蛋白质之间相互作用，往往只有几个非常，往往只有几个非常关键的关键的aa残基残基对结合起到主要对结合起到主要作用，并不是全部蛋白分子参与。作用，并不是全部蛋白分子参与。思考思考如何证明这一命题？如何证明这一命题？基于这种情况，我国科学家基于这种情况，我国科学家来鲁华来鲁华教授课题组教授课题组发展发展了一种了一种“蛋白质蛋白质关键残基嫁接关键残基嫁接”的方的方法

17、。法。成功地将成功地将EPO的的关键关键残基残基“嫁接嫁接”到一个到一个结构完全不同结构完全不同的的PH蛋白蛋白结构结构域域上，上，ERPH1蛋白具有了和蛋白具有了和EPOR结合的功能。结合的功能。促红细胞生成素促红细胞生成素 (EPO)受体受体(EPOR)相互作用，相互作用，促进红细胞促进红细胞的分化和成熟的分化和成熟。来鲁华来鲁华教授教授北京大学化学学院长江特聘教授北京大学化学学院长江特聘教授1987年开始从事年开始从事的交叉研究，的交叉研究，特别是特别是生物信息学生物信息学研究，在研究，在蛋白质结构蛋白质结构预测预测及及分子设计分子设计方面做过大量工作。近年的主方面做过大量工作。近年的主

18、要工作方向为要工作方向为蛋白质蛋白质-蛋白质蛋白质相互作用研究，相互作用研究，发展了用于发展了用于 蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用定量研究的蛋白质相互作用定量研究的 平均势方法。平均势方法。有关蛋白质表面环区结构预测及蛋白质设计、基于结构的药物设计等程序目前在国际有关蛋白质表面环区结构预测及蛋白质设计、基于结构的药物设计等程序目前在国际上拥有上拥有900多家注册用户。多家注册用户。 来鲁华来鲁华教授教授北京大学化学学院北京大学化学学院长江学者长江学者特聘教授特聘教授，北京大学理论生物学中心常务副主任，北京大学理论生物学中心常务副主任，分子动态与稳态国家重点实验室主任，分子动态与稳态国家重点实验室

19、主任，国家国家杰出青年杰出青年基金获得者。基金获得者。来鲁华，博士，教授来鲁华，博士，教授1984年，本科毕业于北京大学年，本科毕业于北京大学化学系化学系。1989年，在北京大学年，在北京大学化学系化学系获博士学位。获博士学位。1998-1999年，美国年，美国加州大学加州大学伯克莱分校伯克莱学者。伯克莱分校伯克莱学者。承担过国家自然科学承担过国家自然科学青年青年基金，基金，国家杰出国家杰出青年基金，青年基金，攀登计划（国家基础研究重大攀登计划（国家基础研究重大计划）计划）项目，项目，八六三八六三项目等。国家自然科学三等奖项目等。国家自然科学三等奖1次，求是基金会青年科学家奖次，求是基金会青年

20、科学家奖励，中国科协青年科技奖等。发表论文近励，中国科协青年科技奖等。发表论文近百百篇，其中篇，其中SCI收录论文收录论文80余篇。余篇。头衔头衔学历学历进修进修贡献贡献研究方向与兴趣研究方向与兴趣个人简历是自己的经历！如何写好，关键做好！个人简历是自己的经历！如何写好，关键做好！详细情况加附页详细情况加附页略略长江学者奖励计划：国家教育部与香港爱国实业家李嘉诚基金会 本节小结本节小结天然蛋白质的天然蛋白质的剪裁，又称蛋白结构的剪裁，又称蛋白结构的“中改中改”，是指在蛋白质中，是指在蛋白质中肽段肽段或或者者结构域结构域替换和拼接替换和拼接。蛋白质的蛋白质的立体结构立体结构是由是由结构元件结构元

21、件组装而成的，通过不同蛋白质之间组装而成的，通过不同蛋白质之间结构结构元件替换和拼接元件替换和拼接。期望期望能够转移相应的功能和特性。能够转移相应的功能和特性。本节主要通过本节主要通过抗体抗体分子的拼接分子的拼接和和改进改进进行了论述。进行了论述。 抗体的人源化（恒定区，抗体的人源化（恒定区，CDR区）区） 抗体的小分子化：双链（抗体的小分子化：双链（Fab和和Fv）、单链（）、单链（ Fab和和Fv ）、双价抗体片段）、双价抗体片段 双特异性抗体双特异性抗体蛋白质关键残基嫁接蛋白质关键残基嫁接实例（方法建立实例（方法建立来鲁华教授）来鲁华教授）第四节第四节 蛋白质分子全新设计蛋白质分子全新设

22、计一、蛋白质分子全新设计的程序一、蛋白质分子全新设计的程序u全新设计？：全新设计？：基于天然蛋白质结构，以及对蛋白质结构与功能关系的认识基于天然蛋白质结构，以及对蛋白质结构与功能关系的认识为基础。根据为基础。根据期望期望的的结构和功能结构和功能来设计来设计全新序列全新序列的分子。的分子。u全新设计流程全新设计流程（7）l确定设计目标确定设计目标l生成初始序列生成初始序列l结构预测结构预测l构建模型构建模型l对序列进行初步的优化对序列进行初步的优化l基因表达全新蛋白质基因表达全新蛋白质 l结构和功能检测结构和功能检测l进一步设计进一步设计 蛋白质设计一般都要经过反复多次蛋白质设计一般都要经过反复

23、多次 设计一合成一检测一再设计的过程。设计一合成一检测一再设计的过程。主要介绍三个环节主要介绍三个环节 设计目标的选择设计目标的选择 设计方法设计方法 结构检测结构检测1 1、设计目标的选择、设计目标的选择蛋白质全新设计分类：（两个方面）。蛋白质全新设计分类：（两个方面）。 功能功能设计和设计和结构结构设计设计。 重点和难点：重点和难点：结构结构设计设计。WhyWhy？设计思路：设计思路：结构设计方面结构设计方面： 从从最简单的最简单的二级结构二级结构开始，开始，摸索摸索蛋白质蛋白质结构结构稳定稳定的规律的规律。 设计目标：设计目标：在超二级结构和三级结构设计中，一般在超二级结构和三级结构设计

24、中，一般选择天然选择天然蛋白质结构中一些比较蛋白质结构中一些比较稳定的模块稳定的模块。 如：如：四螺旋束四螺旋束和和锌指结构锌指结构等。等。功能设计方面功能设计方面： 主要进行天然蛋白质主要进行天然蛋白质功能功能的的模拟模拟， 如：金属结合蛋白和离子通道等如：金属结合蛋白和离子通道等。2、设计方法设计方法（3 3种）种）序列最简化法序列最简化法： 蛋白质分子全新设计的一种基本方法，理解蛋白质分子全新设计的一种基本方法，理解蛋白结构蛋白结构形成的基本规律。形成的基本规律。 尽量使设计序列的尽量使设计序列的复杂性最小复杂性最小，一般仅用很少一般仅用很少几种氨基酸几种氨基酸，从简单到复杂，从简单到复

25、杂 设计的多肽序列具有一定的设计的多肽序列具有一定的对称性或周期性对称性或周期性。 用来理解用来理解蛋白质的折叠规律蛋白质的折叠规律，如：，如：HP模型法（蛋白质折叠研究模型）。模型法（蛋白质折叠研究模型）。模板组装合成法模板组装合成法 （Mutter，1988）：其思路是）：其思路是 将各种将各种二级结构片段二级结构片段通过共价键连接到一个刚性的通过共价键连接到一个刚性的模板分子模板分子上，上，形成形成一一定的定的三级结构三级结构。 模板组装合成法模板组装合成法绕过了绕过了蛋白质三级结构设计的蛋白质三级结构设计的难关难关， 再再 通过改变二级结构中的通过改变二级结构中的AA残基来研究蛋白质中

26、残基来研究蛋白质中AA间的间的长程作用力长程作用力 揭示蛋白质折叠规律，也是揭示蛋白质折叠规律，也是探索探索蛋白质蛋白质全新设计规律全新设计规律的有效手段。的有效手段。自动设计方法自动设计方法提高了设计的速度和效率提高了设计的速度和效率， 已发展多种方法。结合一定的规则和算法，由计算机完成设计已发展多种方法。结合一定的规则和算法，由计算机完成设计。如：。如： 运用蛋白质运用蛋白质反向折叠方法反向折叠方法结合结合遗传算法遗传算法建立自动设计方法建立自动设计方法 运用运用三维剖面技术三维剖面技术结合结合遗传算法遗传算法发展的自动设计方法发展的自动设计方法来鲁华等来鲁华等3 3、结构检测、结构检测（

27、设计蛋白质）（设计蛋白质）只有实践检验，才能判断只有实践检验，才能判断 设计是否与预想设计是否与预想结构结构（结果）符合。（结果）符合。 检测项目和方法：检测项目和方法：（一般从三方面）（一般从三方面）设计的蛋白质是否为设计的蛋白质是否为多聚体多聚体 排阻色谱法排阻色谱法判断分子以几聚体形式判断分子以几聚体形式二级结构含量是否与二级结构含量是否与目标符合目标符合 CDCD法法检测各二级结构的大致含量检测各二级结构的大致含量是否具有是否具有预定预定的三级结构。的三级结构。 主要依靠主要依靠NMRNMR技术和技术和荧光分析荧光分析（下面介绍下面介绍）； 也可使用也可使用X X射线晶体衍射射线晶体衍

28、射技术分析。技术分析。二、二、蛋白质结构的蛋白质结构的全新设计全新设计核心问题核心问题：如何确定一个既如何确定一个既非常稳定非常稳定而又具有而又具有独特的空间结构独特的空间结构的的序列序列。 克服的基本障碍：线性聚合链的克服的基本障碍：线性聚合链的构象熵构象熵。熵增（熵增（S S）？ 序列（正确）折叠的相互作用序列（正确）折叠的相互作用（力），（力），必须超过（大于）构象熵。？必须超过（大于）构象熵。？ 设计时，使设计时，使具有具有相互作用力的相互作用力的AAAA数目与强度数目与强度达到最大。达到最大。 设计原则和经验设计原则和经验： CysCys残基形成残基形成二硫键二硫键的的配对配对无法预

29、测，一般都尽量无法预测，一般都尽量少用甚至不用少用甚至不用，特别是，特别是在自动设计方法中。在自动设计方法中。 序列完成预定折叠后，序列完成预定折叠后，再引入再引入二硫键二硫键来稳定蛋白质的三级结构。来稳定蛋白质的三级结构。 色氨酸色氨酸吲哚环具有吲哚环具有生色性生色性，与其所处环境有关，与其所处环境有关，常以常以TrpTrp做探针做探针？ Trp Trp 在天然态蛋白质分子内部，在天然态蛋白质分子内部，其荧光其荧光光谱光谱发生发生蓝移蓝移。（？）。（？） 在全新设计中常引入在全新设计中常引入TrpTrp作为荧光探针以作为荧光探针以检验检验设计蛋白质的三级结构。设计蛋白质的三级结构。下面介绍各

30、级结构设计的原则下面介绍各级结构设计的原则 从四个方面讲述从四个方面讲述1 1、二级结构的设计（、二级结构的设计（ 、 、T T）（1 1）螺旋的设计螺旋的设计l螺旋的设计螺旋的设计研究较早而且研究得较多的结构研究较早而且研究得较多的结构。WhyWhy？由于由于a a螺旋结构简单，规律性强，在溶液中比较稳定。螺旋结构简单，规律性强，在溶液中比较稳定。l设计指导原则（设计指导原则（4 4个）：个）：选择氨基酸选择氨基酸：形成：形成 螺旋倾向性比较大的残基，如：螺旋倾向性比较大的残基，如：LeuLeu、GluGlu、AlaAla和和MetMet等；等；氨基酸排列氨基酸排列：螺旋每圈平均：螺旋每圈平

31、均3.6个残基，个残基，设计的设计的两亲两亲性螺旋性螺旋，其结构中形成一个亲，其结构中形成一个亲水面和一个疏水面，水面和一个疏水面，疏水性疏水性AAAA残基残基应按应按3 3或或4 4的间隔排列的间隔排列；氢键的指向氢键的指向： 螺旋中所有的氢键指向同一方向，沿螺旋轴形成一个由螺旋中所有的氢键指向同一方向，沿螺旋轴形成一个由N N端指向端指向C C端的端的偶极矩偶极矩，因而设计，因而设计 螺旋时，常使带螺旋时，常使带正电荷正电荷的的AAAA残基靠近残基靠近C C端端，带负电荷带负电荷的的AAAA残基靠近残基靠近N N端端；帽子结构帽子结构：由于：由于a a螺旋两端各有螺旋两端各有3 3个残基个

32、残基的的氢键能力未得到全部满足氢键能力未得到全部满足，为稳定为稳定a a螺螺旋，旋，常常在其两端各加一个常常在其两端各加一个N N帽和帽和C C帽。形成帽。形成N N帽的氨基酸残基有帽的氨基酸残基有GlyGly、AsnAsn、SerSer和和MetMet等，形成等，形成C C帽的有帽的有GlyGly、SerSer、ArgArg和和GlnGln等。等。（2 2） 折叠片结构设计折叠片结构设计 折叠片的设计比折叠片的设计比 螺旋困难。螺旋困难。WhyWhy？ 折叠片的折叠片的氢键氢键在不同的在不同的 折叠股折叠股间形成，间形成，由此由此 折叠片的折叠片的形成形成与序列的与序列的“上下文上下文”的关

33、系更密切。的关系更密切。 单个氨基酸残基单个氨基酸残基平均平均形成的形成的氢键氢键数较螺旋中少，数较螺旋中少，结构稳定性较差结构稳定性较差。单条单条 折叠股折叠股结构结构不能稳定不能稳定存在。存在。如何来研究？如何来研究？ 有了方法才能进行研究有了方法才能进行研究模板组装合成法模板组装合成法 将序列固定在一个模板上，来研究其形成规律。将序列固定在一个模板上，来研究其形成规律。 折叠片的设计原则：折叠片的设计原则： 根据根据 模型肽模型肽、全全 结构结构、/结构结构蛋白质设计蛋白质设计的经验的经验 选择形成选择形成 折叠折叠片片倾向性倾向性较大的氨基酸残基较大的氨基酸残基 ( (如如ValVal

34、、IleIle、Tyr)Tyr) 使使亲水性亲水性残基和残基和疏水性疏水性残基残基相间排列相间排列。（3 3）转角的设计）转角的设计：转角的作用：转角的作用： 连接连接不同二级结构不同二级结构的常见的常见单元单元，对维持各种二级结构的，对维持各种二级结构的空间相对位置空间相对位置和和稳定稳定蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构起着重要的作用。起着重要的作用。 不同类的不同类的转角转角对对每个位置的每个位置的氨基酸残基的氨基酸残基的二面角二面角有一定的要求。有一定的要求。 二面角二面角决定连接的决定连接的两个二级结构两个二级结构的的空间关系空间关系。转角设计的关键转角设计的关键 选择选择合适的转角类

35、型合适的转角类型。 某些某些氨基酸残基氨基酸残基对蛋白质的二级结构有终止作用对蛋白质的二级结构有终止作用 如：如：ProPro和和GlyGly是是 螺旋的中断者；螺旋的中断者； GluGlu是是折叠的中断者；折叠的中断者； 设计时可利用这些氨基酸残基来设计时可利用这些氨基酸残基来终止和分隔终止和分隔不同的二级结构。不同的二级结构。 2 2、超二级结构和三级结构的设计、超二级结构和三级结构的设计l主要结构类别：主要结构类别： - - ； - - ， -发夹；发夹；三级结构；全蛋白三级结构；全蛋白。l设计的重要问题（两个）设计的重要问题（两个） 氨基酸选择：根据氨基酸选择：根据AAAA形成形成二级

36、结构的二级结构的倾向性倾向性，选择选择各二级结构片段的各二级结构片段的氨氨基酸残基基酸残基 疏水中心的形成：疏水中心的形成：最重要的一点就是考虑最重要的一点就是考虑疏水中心疏水中心的形成。的形成。l螺旋螺旋螺旋结构螺旋结构： 很多很多跨膜蛋白跨膜蛋白中存在，是研究得比较多的中存在，是研究得比较多的超二级结构超二级结构。 序列有一个序列有一个明显的结构特征明显的结构特征，即存在一个，即存在一个周期性重复周期性重复的的七肽七肽 例如：七肽例如：七肽 a abcbcd defg efg ，其中，其中a a和和d d位置位置处于处于螺旋间螺旋间的界面的界面 因而设计时应选择因而设计时应选择疏水性疏水性

37、氨基酸残基，氨基酸残基， 其他位置其他位置暴露暴露的表面，应选择的表面，应选择亲水的亲水的氨基酸残基。氨基酸残基。-发夹结构发夹结构（另一种常见的超二级结构） 合成合成-发夹模型的重要性发夹模型的重要性 ， Why？-发夹发夹在在-折叠折叠片形成片形成中中具有具有成核成核作用作用。单独单独-发夹结构，发夹结构，不能稳定存在不能稳定存在，形成分子间，形成分子间-折叠片折叠片才能稳定才能稳定。若能合成若能合成-发夹发夹模型肽，才能对模型肽，才能对-折叠片中折叠片中各种各种稳定因素稳定因素进行研究。进行研究。 -发夹发夹模型模型的设计与合成的设计与合成研究发现，研究发现，G G蛋白蛋白B1B1结构域

38、中的结构域中的一个片段一个片段在水溶液中能够在水溶液中能够折叠成折叠成单单体的体的天然天然-发夹结构发夹结构。根据这一发现，设计出了根据这一发现，设计出了8 8个氨基酸个氨基酸残基组成的具有残基组成的具有-发夹结构的发夹结构的模模型肽。型肽。 -发夹设计的关键：发夹设计的关键： -转角转角的设计的设计，特别是选择合适的，特别是选择合适的转角类型转角类型。l三级结构的设计三级结构的设计 设计思路：设计思路：模仿天然蛋白质模仿天然蛋白质中较中较稳定的稳定的结构结构模块模块。 设计较难，但已有多个成功的设计实例，设计较难，但已有多个成功的设计实例， 如：如：Richardson等设计的等设计的全全蛋

39、白质蛋白质著名的著名的 betabellin（ -桶桶 ），由前后两个由前后两个-折叠组成，每个折叠由折叠组成，每个折叠由4股组成。股组成。 如：如： Goraj等设计的等设计的 octarellin 即即(/ )8。结构单元是结构单元是turn- strand-turn- helix。 构建的合成基因在构建的合成基因在E.coli 中的表达中的表达 三级结构设计三级结构设计极为困难极为困难，为使结构更稳定，设计中常引入，为使结构更稳定，设计中常引入二硫键或金属离子二硫键或金属离子。但但 Struthers等等根据根据锌指结构锌指结构成功地设计了成功地设计了一个一个23肽肽三级结构，三级结构，

40、不含二硫键，也不含二硫键，也没有金属离子没有金属离子，其结构通过，其结构通过NMR检测证实。检测证实。结构中同时包含了结构中同时包含了-螺旋、螺旋、-折叠以及转角，全部使用天然氨基酸。折叠以及转角，全部使用天然氨基酸。其其重要意义重要意义是是第一个全自动设计的蛋白质第一个全自动设计的蛋白质。 是迄今为止是迄今为止几个成功的三级结构几个成功的三级结构设计实例之一。设计实例之一。此外，此外，Fedorov等还进行了自然界不存在的等还进行了自然界不存在的全新结构设计全新结构设计的尝试。的尝试。在目前的设计中在目前的设计中，CD谱计算谱计算的二级结构含量与的二级结构含量与目标基本相符目标基本相符，就算

41、设计成功就算设计成功。正常折叠的问题正常折叠的问题l全新蛋白设计全新蛋白设计u局限性（对结构和功能关系局限性（对结构和功能关系认识不足）认识不足） 对一些对一些结构简单、规律明显的蛋白质分子的设计结构简单、规律明显的蛋白质分子的设计。 其中其中最著名最著名的例子的例子四螺旋束四螺旋束和和-筒结构筒结构。 四螺旋束和四螺旋束和-筒结构是筒结构是自然界中广泛存在的结构类型自然界中广泛存在的结构类型，（稳定的结构），（稳定的结构）例如：在细胞色素、蚯蚓血红蛋白、烟草镶嵌病毒外壳蛋白等多种蛋白质都含有例如：在细胞色素、蚯蚓血红蛋白、烟草镶嵌病毒外壳蛋白等多种蛋白质都含有相连的相连的四螺旋束四螺旋束 。

42、 为什么要设计这些蛋白结构，具有什么特点？为什么要设计这些蛋白结构，具有什么特点？ 结构非常稳定，结构非常稳定，这些这些蛋白的同源性很小蛋白的同源性很小，具有相似的三维结构具有相似的三维结构， 因此，这些结构类型成为因此，这些结构类型成为从头设计的目标从头设计的目标。Degrado等设计的四螺旋束等设计的四螺旋束 从头设计从头设计结构结构 简要介绍这两种结构简要介绍这两种结构科学研究的切入点科学研究的切入点和选材非常重要。和选材非常重要。u四螺旋束四螺旋束结构设计结构设计蛋白质蛋白质全新分子设计全新分子设计的的“里程碑里程碑” Degrado等（杜邦公司）设计合成的四螺旋束结构：等（杜邦公司）

43、设计合成的四螺旋束结构：4段螺旋的序列完全相同段螺旋的序列完全相同，各由，各由16个氨基酸残基组成，螺旋之间的个氨基酸残基组成，螺旋之间的3段连接段连接也完全也完全相同，各由相同，各由3个个AA残基残基组成，共组成，共74个个AA残基残基。 。一级序列：一级序列： 螺旋螺旋( helix): Gly-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Lys-Gly 连接连接(loop)：Pro-Arg-Arg 肽链：肽链：NH-Met- Helix-Ioop- Helix- Loop- Helix-Loop-Helix-COOH设计构想设计

44、构想一级序列设计，着重选择了一级序列设计，着重选择了Leu、Lys和和Glu三种残基。三种残基。其中仅其中仅Leu为为疏水残基疏水残基，排布在，排布在螺旋内侧螺旋内侧，Lys和和Glu为为带电荷带电荷残基，排布在螺旋残基，排布在螺旋外侧外侧，螺旋的两端各加上螺旋的两端各加上1个个Gly，中断螺旋中断螺旋，后面加上，后面加上连接肽段连接肽段。整个四螺旋束结构具有整个四螺旋束结构具有对称性对称性。相邻螺旋相邻螺旋反平行反平行，螺旋轴夹角大约螺旋轴夹角大约18度。度。疏水残基在内部疏水残基在内部，极性残基在表面，极性残基在表面，整个螺旋呈两性整个螺旋呈两性。这个设计实例被誉为蛋白质分子设计的这个设计

45、实例被誉为蛋白质分子设计的“里程碑里程碑”Degrado等设计的四螺旋束等设计的四螺旋束 u折叠结构设计举例折叠结构设计举例喇叭筒状蛋白质喇叭筒状蛋白质 由由2个完全相同的个完全相同的折叠片层折叠片层组成，每一片层包含组成，每一片层包含4条条-折叠股折叠股。 前前3条条折叠股各有折叠股各有8个个残基，最后一条由残基，最后一条由7个个残基，残基，每一片层每一片层31个个残基残基。设计思想：设计思想： 考虑到形成考虑到形成折叠的倾向性折叠的倾向性以及以及肽链之间的相互作用肽链之间的相互作用， 选择了选择了Thr、Ser、Val、Leu、Ile和和Ala等残基。等残基。 Thr和和Ser是极性残基，

46、位于是极性残基，位于表面表面，以便与，以便与溶剂形成氢键溶剂形成氢键； Val、Leu和和Ile是疏水性残基，构成是疏水性残基，构成形成体形成体； Ala体积小，有利于体积小，有利于内部堆积内部堆积。 残基位置排布残基位置排布，充分考虑了，充分考虑了链之间的链之间的成对效应成对效应， 尽可能地安排尽可能地安排疏水残基疏水残基与与疏水残基疏水残基相对排列，相对排列， 带异性电荷的残基带异性电荷的残基相对相对排列，排列， 带有带有大支链大支链的残基与的残基与不带支链不带支链的残基的残基相对相对排列，排列， 这样的排布使得在肽链之间产生这样的排布使得在肽链之间产生最强最强的相互作用。的相互作用。 两

47、个片层依靠两个片层依靠交联分子连接在一起，形成了一个筒状结构交联分子连接在一起，形成了一个筒状结构。从头设计从头设计结构结构 三、三、蛋白质功能蛋白质功能的全新设计的全新设计l模仿模仿特定功能的结构域特定功能的结构域为基础为基础进行蛋白质进行蛋白质功能功能的全新设计。的全新设计。 蛋白质蛋白质结构结构决定蛋白质的功能。决定蛋白质的功能。 因而蛋白质因而蛋白质功能的设计功能的设计也离不开蛋白质的也离不开蛋白质的结构特点结构特点， 目前，以目前，以特定的结构域特定的结构域模拟模拟天然蛋白质天然蛋白质的的功能功能。 最终实现人工设计功能蛋白。最终实现人工设计功能蛋白。 设计思路设计思路举例举例螺旋螺

48、旋螺旋螺旋结构结构模拟模拟离子通道离子通道蛋白。蛋白。l“翻转翻转”的的Rop蛋白结构，设计了蛋白结构，设计了H+通道蛋白通道蛋白（ DeGrado等）等）p将将Rop蛋白蛋白中的中的疏水残基疏水残基变成变成亲水残基亲水残基，p将其将其亲水残基亲水残基换成换成疏水残基疏水残基，形成，形成疏水的外表面疏水的外表面和和亲水的内核亲水的内核。p为使设计的结构为使设计的结构具有具有离子通道功能离子通道功能，内核内核不是不是设计成一般的设计成一般的紧密堆积紧密堆积形式，而是为水分子和离子留下足够的空间。形式，而是为水分子和离子留下足够的空间。p因此，选择了因此，选择了侧链最小侧链最小的的亲水性亲水性AA

49、残基残基丝氨酸丝氨酸，p合成了合成了21个个AA残基组成的残基组成的a螺旋螺旋H2N(LSLLLSL)3CONH2p由三股由三股a螺旋组成一个螺旋组成一个H+通道模型通道模型。l他们还设计了可以容纳他们还设计了可以容纳更大离子更大离子的的四螺旋离子通道四螺旋离子通道模型。模型。抑制蛋白质与蛋白质相互作用抑制蛋白质与蛋白质相互作用的的短肽的设计短肽的设计设计背景和思想：设计背景和思想：AD 发病机理：发病机理：阿尔茨海默病阿尔茨海默病（简称（简称AD或老年性痴呆病）或老年性痴呆病）可溶的可溶的39-42个残基的个残基的短肽短肽() 和和（简称（简称 ），转变成），转变成不可溶性不可溶性的淀粉样纤

50、维或斑，的淀粉样纤维或斑，在病人的在病人的大脑中聚集大脑中聚集，导致，导致AD病的发生。病的发生。淀粉样纤维淀粉样纤维的的稳定性稳定性是通过是通过折叠层间折叠层间的的氢键结合氢键结合而聚集的。而聚集的。根据这个原理，（根据这个原理，（Ernest Giralt博士的实验室）设计一个短肽，能博士的实验室）设计一个短肽，能抑制抑制形成淀粉形成淀粉样纤维样纤维。抑制短肽的作用和特点：抑制短肽的作用和特点：短肽有短肽有正常的形成氢键的能力正常的形成氢键的能力，以便能与，以便能与 分子分子结合。结合。短肽在短肽在肽键骨架肽键骨架的的N原子原子上有一个甲基，上有一个甲基，抑制抑制分子与之结合分子与之结合，