微生物限度检查法课件.ppt

1、 微生物限度检查法微生物限度检查法 江苏省苏州药品检验所细菌、细菌、 霉菌（酵母菌）霉菌（酵母菌） 计数计数n1简述（简述（微生物限度检查的意义微生物限度检查的意义）n细菌、霉菌、酵母菌计数是检测规定企业细菌、霉菌、酵母菌计数是检测规定企业单位内的非灭菌制剂污染的活菌数量，是单位内的非灭菌制剂污染的活菌数量，是判定药品受到微生物污染程度的重要指标，判定药品受到微生物污染程度的重要指标，也是对生产企业的药品、原料、辅料、设也是对生产企业的药品、原料、辅料、设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。卫生状况进行卫生学评价的综合依

2、据之一。细菌、霉菌、酵母菌计数均细菌、霉菌、酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是采用平板菌落计数法，这是活菌计数方法之一，也是目活菌计数方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一前国际上许多国家常用的一种方法。种方法。n该方法以在琼脂平板上，每个细菌该方法以在琼脂平板上，每个细菌（营养琼脂）、霉菌（玫瑰红钠琼（营养琼脂）、霉菌（玫瑰红钠琼脂）、酵母菌（玫瑰红钠琼脂或酵脂）、酵母菌（玫瑰红钠琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂）形成一个母浸出粉胨葡萄糖琼脂）形成一个独立可见的菌落为计数依据。独立可见的菌落为计数依据。n测定结果只反映在规定条件下所测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（一群在营养琼脂上生长

3、的细菌（一群在营养琼脂上发育的嗜中温、需氧和兼性厌氧发育的嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、不包括对营养、氧气、温度、PH和其他因素有特殊要求的细菌、和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。霉菌和酵母菌。n一个细菌、霉菌和酵母菌菌落均可一个细菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一个或多个菌细胞形成。因此供由一个或多个菌细胞形成。因此供试品中所测的菌落数实际为菌落形试品中所测的菌落数实际为菌落形成单位数（成单位数（colony forming unit ，CFU），），而不应理解为细菌、霉菌、而不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。酵母

4、菌的个数。微生物检验项目微生物检验项目：细菌总数测定、：细菌总数测定、霉菌与酵母菌总数测定、控制菌检验霉菌与酵母菌总数测定、控制菌检验（包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙（包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、金黄葡萄球菌、破伤风梭菌）以门菌、金黄葡萄球菌、破伤风梭菌）以及活螨的检验。及活螨的检验。n2.1 设备设备n2.1.1 无菌室无菌室n2 设备、仪器及用具设备、仪器及用具n2.1.1.1结构和要求结构和要求 无菌室应采光良无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区好、避免潮湿、远离厕所及污染区（面积不超过（面积不超过10m2，高度不超过高度不超过2.4m）由缓冲间（由缓冲间（2个）、操

5、作间组个）、操作间组成。成。n操作间与缓冲间之间应有样品传递操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，出入操作间和缓冲间的门不应箱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。直对。 n无菌室内应六面光滑平整，能耐受无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙与地面及墙壁、天花清洗消毒。墙与地面及墙壁、天花板连接处应呈凹弧形无缝隙，不留板连接处应呈凹弧形无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。死角。操作间内不应安装下水道。n无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于室内光照应分布均匀，光照度不低于300勒克斯。缓冲间和操作间均应设勒克斯。缓冲间和操作间均应

6、设置紫外线杀菌灯（置紫外线杀菌灯（.5W/m3），），紫外杀菌灯应距实验台面高度不超过紫外杀菌灯应距实验台面高度不超过1M，并应定期检查辐射强度，不得并应定期检查辐射强度，不得低于低于70W.cm-2（M距离）。不距离）。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。n2.1.1.2温度、湿度温度、湿度 无菌室内温度无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外杀菌灯杀和相对湿度直接影响紫外杀菌灯杀菌效果，故温度应控制在菌效果，故温度应控制在1826，相对湿度，相对湿度4060。操作。操作间或净化工作台的洁净空气应保持间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压、不低于对环境形成正压、

7、不低于4.9Pa。n2.1.1.3操作间操作间 操作间应安装空气操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不应低除菌过滤层流装置。洁净度不应低于是于是10000级，局部净化度为级，局部净化度为100级，或放置同等级净化工作台，并级，或放置同等级净化工作台，并准备药物天平，乙醇灯，火柴，乙准备药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉，大、小橡皮乳头等。醇棉，大、小橡皮乳头等。n2.1.1.4缓冲间缓冲间 缓冲间内应有洗手缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不应放置培养箱和其他杂缓冲间内不应放置培养箱和其他杂物。物。n2.1.1.5洁净洁净 级级 别别 及及 检

8、检 查方法查方法 通通常采用尘常采用尘 粒粒 数数 及及 浮浮 游游 菌菌 数数 或或 沉沉 降降 菌菌 数测数测 定定 法。法。 洁净室（区）空气洁净度级别表洁净室（区）空气洁净度级别表洁净度级洁净度级别别尘粒最大允许数尘粒最大允许数 /立方米立方米 0.5m5m百级百级3，5000万级万级350，0002，000十万级十万级3，500，00020，000三十万级三十万级10，500，00060，000级别级别微生物最大允许数微生物最大允许数 换气次数换气次数/小时小时 浮游菌浮游菌/立方米立方米沉降菌沉降菌 / 皿皿 百级百级510.3米米/秒秒万级万级100320十万级十万级500101

9、5三十万级三十万级15-n2.1.1.5.1 浮游菌数测试方法（参照浮游菌数测试方法（参照中 人 民 共 和 国 国 家 标 准中 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/T16293-1996）。）。n2.1.1.5.2 沉降菌数测定沉降菌数测定(法法) n无菌室操作台消毒擦拭处理后，先无菌室操作台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置启动层流净化装置30min，将备妥的将备妥的营养琼脂平板营养琼脂平板3个个(经经3035预培养预培养48h，证明无菌落生长。证明无菌落生长。)以无菌方式以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各化台左、中、右各1个，开盖

10、，暴露个，开盖，暴露30min后将盖盖上。后将盖盖上。 在在3035培养箱内倒置培养培养箱内倒置培养48h，取出检查。取出检查。 3个平板生长的平均菌落个平板生长的平均菌落数不超过数不超过1个。个。 n无菌室操作台或净化工作台要定期无菌室操作台或净化工作台要定期检测其洁净度，应达到检测其洁净度，应达到100级。净级。净化工作台中的高效及中效过滤器应化工作台中的高效及中效过滤器应根据检测情况，必要时予以更换处根据检测情况，必要时予以更换处理。理。n2.1.1.6消毒处理消毒处理 无菌室应在每次无菌室应在每次操作前、后均用操作前、后均用.1%苯扎溴铵溶苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可液或其他

11、消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。开动层流净化装能污染的死角。开动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射置，同时用紫外杀菌灯照射30min。 n2.1.2其他设备、净化工作台、恒温其他设备、净化工作台、恒温培养箱（培养箱（3035）、生化培养箱）、生化培养箱（2528），微波炉（或其他适），微波炉（或其他适宜加热装置）、康氏振荡器、匀浆宜加热装置）、康氏振荡器、匀浆仪（仪（30008000r/min）、）、恒温恒温水浴、电热干燥箱（水浴、电热干燥箱（250300）、）、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果检查并应（使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门

12、检定）。定期请有关部门检定）。n2.2 仪器及器皿仪器及器皿n2 . 2 . 1 菌 落 计 数 器 、 显 微 镜菌 落 计 数 器 、 显 微 镜（1500X）、）、电子天平或药物天平电子天平或药物天平（感量（感量0.1g），），pH系列比色计。系列比色计。 n2.2.2 玻璃器皿玻璃器皿 锥形瓶锥形瓶(250300ml，内装玻璃珠若干内装玻璃珠若干)、研钵（陶瓷制，、研钵（陶瓷制，直径直径1012cm）、）、培养皿培养皿(9cm)、量筒量筒(100ml)、试管试管(18180mm)及及塞、吸管塞、吸管(1ml分度分度0.01，10ml分度分度0.1)、注射器、注射器(20或是或是30ml

13、)、注射针注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸(带盖带盖) 。n玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质吸管口上端距抗菌物质吸管口上端距0.5cm处塞处塞入约入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，再用牛试管均应加棉塞或硅胶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于皮纸包扎。玻璃器皿，均于160干热灭菌干热灭菌2h或高压蒸汽或高压蒸汽121灭菌灭菌30min，烘干备用。烘干备用。n2.3 用具用具n2.3.1 大、小橡皮乳头（放于干净大、小橡皮

14、乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用带盖的容器中，并应定期用70%75%乙醇溶液浸泡）。乙醇溶液浸泡）。n2.3.2 无菌衣、帽、口罩、手套无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。帽、口罩、手套。n2.3.3 接种环接种环 (白铱金或镍铬合金，白铱金或镍铬合金， 环径环径45mm、长度长度610cm)、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈

15、钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、）、实实验记录纸等。验记录纸等。n3 试液试液 n3.1消毒液消毒液n3.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用）。擦拭操作台面用）。n3.1.2 5%石碳酸溶液石碳酸溶液 (配好后装入配好后装入玻璃消毒缸内，玻璃消毒缸内， 供消毒带菌吸管用供消毒带菌吸管用) 亦可选用其他适宜消毒液。亦可选用其他适宜消毒液。n3.1.3 75%乙醇溶液乙醇溶液n3.1.4 碘酊或碘伏溶液碘酊或碘伏溶液n3.2 稀释剂和试剂稀释剂和试剂n3.2.1 0.9%无菌

16、无菌n氯化钠溶液氯化钠溶液 (附录附录3.1)n3.2.2 无菌聚山梨酯无菌聚山梨酯-80n3.2.3 无菌聚山梨酯无菌聚山梨酯-80氯化钠溶液氯化钠溶液 (附录附录3.2)n3.2.4 无菌磷酸盐缓冲液无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) (附录附录3.3)n3.2.5 无菌无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶氯化三苯四氮唑溶液液(TTC) (附录附录2.15)n4 培养基培养基 n4.1 营养琼脂培养基营养琼脂培养基 (附录附录5.2)n4.2 玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基 (附录附录5.3) n4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖酵母浸出粉胨葡萄糖 (YPD) 琼脂培养基琼脂培养基 (附录附录5.4)n

17、培养基制备应注意：培养基制备应注意：n4.3.1 采用干燥培养基，按说明配采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基制，应对灭菌后的培养基pH值进行值进行校验。若为自配培养基，原料应挑校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上的试剂。纯以上的试剂。n4.3.2 配制的培养基不应有沉淀，如配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。后使用。n4.3.3 培养基的分装量不得超过容器培养基的分装量不得超过容器的确的确2/3，以免灭

18、菌时溢出。包装时，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。染菌。n4.3.4 培养基配置后应在培养基配置后应在2h内灭菌，内灭菌，避免细菌繁殖。避免细菌繁殖。n4.3.5 灭菌后的培养基在冷暗处保存灭菌后的培养基在冷暗处保存备用，放置时间不能过长，以免水备用，放置时间不能过长，以免水分散失及染菌。已熔化的培养基应分散失及染菌。已熔化的培养基应一次用完，开启后不宜再用。一次用完，开启后不宜再用。 n4.3.6 勿用电炉直接熔化琼脂培养基，勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份过度受热而破坏。应以免营养成份过度受热而破坏。应用水浴或微波炉加热

19、。用水浴或微波炉加热。n5 供试品抽样、保存及检验量供试品抽样、保存及检验量n5.1 抽样抽样 n5.1.1 一般采用随机抽样方法，抽一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（样量应为检验用量（2个以上最小包个以上最小包装单位）的装单位）的3倍量（以备复试）。倍量（以备复试）。n5.1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤机械损伤、明显破裂的包装不得作明显破裂的包装不得作为样品。为样品。 n5.1.3 凡能从药品、瓶口（外盖内凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发侧及瓶口周围）外观看出长螨、

20、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需再抽样检验。为不合格，无需再抽样检验。n5.2 保存保存n5.2.1 供试品在检验之前，应保存供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死，损伤或繁殖。引起致死，损伤或繁殖。n5.2.2 供试品在检验之前，应保持原供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。的样品不得作为供试品。n5.3 检验量检验量n5.3.1 所有剂型的检验量均需取所有剂型的检验

21、量均需取2个个以上包装单位（中药蜜丸、膜剂，以上包装单位（中药蜜丸、膜剂，需取自需取自4丸、丸、4片以上）。片以上）。n5.3.2 固体及半固体固体及半固体(粘稠性供试品粘稠性供试品)制剂检验量为制剂检验量为10 g。n5.3.3 液体制剂检验量为液体制剂检验量为10 ml。n5.3.4 膜剂除另有规定外，中药膜膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为剂检验量为3050cm2，化学药及化学药及生化药膜剂检验量为生化药膜剂检验量为10cm2。n5.3.5 特殊贵重或微量包装的药品，特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口检验量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于服固体制剂不低于3g

22、。液体制剂采液体制剂采用原液者不得少于用原液者不得少于6ml，采用供试采用供试液者不得少液者不得少3ml，外用药品不得少外用药品不得少5g。 n6 操作方法操作方法n6.1 试验前准备试验前准备n6.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10ml）、）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。将全部外包装（牛皮纸）去掉。

23、n6.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和空开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于气过滤装置，并使其工作不低于30min。 n6.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。戴无菌衣、帽、口罩、手套。n6.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口

24、处周围，待干后用灭菌的手术镊处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。或剪将供试品启封。n6.2 供试液的制备供试液的制备n6.2.1 液体供试品液体供试品 取供试品取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，稀释剂，摇匀，作为摇匀，作为1:10供试液。供试液。n含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂直接用供试品作为供试液。直接用供试品作为供试液。n6.2.2 固体、半固体或粘稠供试品固体、半固体或粘稠供试品 称取供试品称取供试品10g，置于匀浆杯或适当置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入灭菌容器中，加入100ml 0.9%无菌无菌氯化钠溶液

25、，用匀浆仪氯化钠溶液，用匀浆仪（30005000r/，24min），），振荡器或乳钵振荡器或乳钵研磨等方法分散混匀。胃溶胶囊加研磨等方法分散混匀。胃溶胶囊加稀释剂后置稀释剂后置451水浴中振摇，肠水浴中振摇，肠溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后先打溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后先打碎再置碎再置451水浴振摇溶解。水浴振摇溶解。n6.2.3 非水溶性供试品非水溶性供试品 软膏剂、软膏剂、乳膏剂乳膏剂 称供试品称供试品5g（5ml），），加入加入含已灭菌溶化并保温含已灭菌溶化并保温45左右的司左右的司盘盘-80 5g、单硬脂酸甘油酯单硬脂酸甘油酯3g、聚聚山梨酯山梨酯-80 10g混合物的烧杯中，混合物的烧杯

26、中，用无菌玻棒搅拌均匀后，慢慢加入用无菌玻棒搅拌均匀后，慢慢加入45左右的左右的0.9%无菌氯化钠溶液无菌氯化钠溶液85ml，边加边搅拌，使供试品充分边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液（乳化，作为供试液（1：20）。）。 n油剂油剂 取供试品取供试品10ml，加入无菌聚加入无菌聚山梨酯山梨酯-80 58ml，摇匀，再加入摇匀，再加入稀释剂至稀释剂至100ml。n栓剂栓剂 称取供试品称取供试品10g，置灭菌锥形置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置瓶中，加适量稀释剂，置45水浴水浴保温保温10min，使溶，加入无菌聚山使溶，加入无菌聚山梨酯梨酯-80 58ml，振摇使之乳化，振摇使之乳化，再加稀

27、释剂（稀释剂和聚山梨酯再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯-80总量为总量为100ml），摇匀。摇匀。n6.2.4 气雾剂气雾剂 将供试品置冰箱（将供试品置冰箱（4）h，取出，用碘伏棉球（也取出，用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品开启部可用乙醇棉球）擦拭供试品开启部位周围，然后以无菌钢锥仔细钻孔位周围，然后以无菌钢锥仔细钻孔并插入容器中，勿移出钢锥，以转并插入容器中，勿移出钢锥，以转动方式使容器内抛射剂全部抛出。动方式使容器内抛射剂全部抛出。n以无菌注射器吸出全部药液，按标以无菌注射器吸出全部药液，按标示量补加稀释剂至足量（若含非水示量补加稀释剂至足量（若含非水溶性成份，加适量无菌聚山梨酯溶性成份

28、，加适量无菌聚山梨酯-80液）此液即为供试品原液。液）此液即为供试品原液。 n6.2.5 膜剂膜剂 中药膜剂一般取中药膜剂一般取3050cm2， 将药膜剪成碎片，置灭菌将药膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中，锥形瓶中， 加入稀释剂加入稀释剂100ml， 于于451水浴保温，振摇使溶。水浴保温，振摇使溶。n西药药膜一般取样为西药药膜一般取样为10cm2，制备制备供试液方法同上。供试液方法同上。n6.2.6 茶剂茶剂 取供试品取供试品10g， 置灭菌置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂锥形瓶中，加入稀释剂100 ml，振振摇摇30s，以灭菌纱布过滤（如为袋以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取泡茶，可直接取2袋，以称

29、样结果袋，以称样结果按按1：10加稀释剂，浸泡加稀释剂，浸泡30min）。）。n以上供试品如吸水膨胀，或粘度过以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，增加稀释剂，制成都是高，增加稀释剂，制成都是1：201：100供试液。供试液。n6.3 供试液的稀释（供试液的稀释（10倍递增稀释倍递增稀释法）法）n6.3.1 取取23支灭菌试管，分别加入支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂（此时操作一般为：灭菌稀释剂（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开，倾斜，右手左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执执10ml吸管吸量，注意：勿在乙醇灯吸管吸量，注意：勿在乙醇灯焰峰正上方操作，以免灯焰将供试液焰峰正上方操作，以免灯焰

30、将供试液中菌细胞杀灭）。加完稀释剂后，试中菌细胞杀灭）。加完稀释剂后，试管塞应立即塞上。管塞应立即塞上。 n6.3.2 另取另取1支支1ml灭菌吸管吸灭菌吸管吸1：10均匀供试液均匀供试液1ml，加入装有加入装有9ml灭菌稀释剂的试管中混匀，即为灭菌稀释剂的试管中混匀，即为1：100供试液。以此类推，根据供试供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至品污染程度，可稀释至1：102、1：103、1：104等适宜稀释级（至少等适宜稀释级（至少共共3级）。每递增级）。每递增1稀释级，必须另稀释级，必须另换一支吸管。换一支吸管。n在作在作10倍递增稀释时，倍递增稀释时， 吸管插入第吸管插入第1级稀

31、释液内不低于液面级稀释液内不低于液面2.5cm， 反复反复吸吹约吸吹约10次。吸液时，应先吸至高次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，于吸管上部刻度少许， 然后提起吸然后提起吸管，管， 贴于试管内壁调整液量至刻度，贴于试管内壁调整液量至刻度， 再沿第再沿第2级稀释管的内壁靠近液面级稀释管的内壁靠近液面(勿接触液面勿接触液面)缓慢地吹出全部供试液缓慢地吹出全部供试液(吸管内应无粘附或残留液体吸管内应无粘附或残留液体)，然后，然后将吸管放入消毒液缸内。将吸管放入消毒液缸内。 n6.4 注平皿注平皿 在进行在进行10倍递增稀释的同倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取各级稀释时，以该稀释级吸管，

32、吸取各级稀释液各液各1ml至每个灭菌平皿中（从高稀至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低稀释级吸液时可用释级至低稀释级吸液时可用1支吸支吸管），每一稀释级注管），每一稀释级注23个平皿（此个平皿（此时，一般为左手执平皿，将盖半开，时，一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将右手执吸管），注平皿时，将1ml供供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。留液体，防止反流到吸管尖端部。n同时作阴性对照（待各级稀释液注同时作阴性对照（待各级稀释液注皿完毕后，用皿完毕后，用1支支1ml吸管吸取稀释吸管吸取稀释剂各剂各1ml，分别注入分别注入4个

33、平皿中。其个平皿中。其中中2个作细菌阴性对照；另二个作霉个作细菌阴性对照；另二个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增琼脂测定酵母菌数时，则再增加加2个平皿作酵母菌数阴性对照）。个平皿作酵母菌数阴性对照）。n6.5 倾注培养基倾注培养基 将预先配制好的培将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红纳琼脂，酵母菌计数一般用玫瑰红纳琼脂，含蜂蜜、王浆液体制剂另加用含蜂蜜、王浆液体制剂另加用YPD琼脂）熔化，冷至琼脂）熔化，冷至45时，倾注上时，倾注上述各个平皿述各个平皿15ml，以顺时针

34、或反时以顺时针或反时针方向快速旋转平皿混匀，注意，针方向快速旋转平皿混匀，注意，混匀时切勿将培养基溅到皿边及皿混匀时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上，置操作台上待凝。盖上，置操作台上待凝。n6.6 培养培养 细菌计数平板倒置于细菌计数平板倒置于3035培养箱中培养培养箱中培养48h。霉菌、酵母霉菌、酵母菌计数平板于菌计数平板于2528培养箱中培培养箱中培养养72h。n6.7 菌落计数菌落计数n6.7.1 一般将平板置菌落计数器上或一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内

35、和平皿边缘生长的计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的鉴别。必要时养基沉淀物、气泡等的鉴别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。挑取可疑物涂片镜检。 n6.7.2 供试品如为微生物制剂，应供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定，的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察

36、菌落特征及染色形态。并须观察菌落特征及染色形态。n6.7.3 供试品稀释液常含有不溶性原供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后可能产生沉料、辅料，培养基注皿后可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多淀物，经过培养后有时形成数量很多且难与菌落肉眼相鉴别的有形物。为且难与菌落肉眼相鉴别的有形物。为了有利于菌落计数，可在操作时将适了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（宜稀释级的供试液多增加注皿（12个平皿），注皿后不经培养而放置于个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。为对照。n或用或用0.001%TT

37、C营养琼脂注皿，经营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。区别开来。n有些软膏等非水溶性供试品，经营有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用这种情况，也可用0.001%TTC营养营养琼脂注皿，经培养后生长的菌落为琼脂注皿，经培养后生长的菌落为红色，衬于白色背景上易于点计。红色，衬于白色背景上易于点计。n6.7.4 若平板上有若平板上有2 个或个或2个以上菌个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或个或2个

38、以上菌落计数；若平板生长有链个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界限，一条状菌落，菌落间无明显界限，一条链作为一个菌落计，但若链上出现链作为一个菌落计，但若链上出现性状与链状菌落不同的可辨菌落时，性状与链状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大仍应分别计数，若生长蔓延的较大片状菌落或花斑样菌落，一般不宜片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。作为计数用。n6.7.5 计录各稀释级平板的菌落数，求计录各稀释级平板的菌落数，求出各稀释级出各稀释级2或或3个平板菌落的平均数。个平板菌落的平均数。当菌落数在当菌落数在15以上的同稀释级二平板以上的同稀释级二平板菌落数相差菌

39、落数相差1倍时，该稀释级菌落数不倍时，该稀释级菌落数不得作为计数依据；当得作为计数依据；当2个平板菌落数均个平板菌落数均在在15（含（含15）以下时，两个平板菌落）以下时，两个平板菌落数的差值允许范围为数的差值允许范围为04，17，2-9，310，412，514，615。超出。超出以上范围即视为操作误差，不得作为以上范围即视为操作误差，不得作为计数依据。计数依据。n6.7.6 在下列情况下、点计菌落时间在下列情况下、点计菌落时间需提前或延长培养时间：需提前或延长培养时间： n6.7.6.1 菌落生长呈蔓延趋势者，细菌落生长呈蔓延趋势者，细菌点计需在菌点计需在24h，霉菌点计需在霉菌点计需在48

40、h作初步点计（点计霉菌菌落时，动作初步点计（点计霉菌菌落时，动作宜轻，勿反复翻转平板或造成震作宜轻，勿反复翻转平板或造成震动，使早期形成的孢子散落在平板动，使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差）。导致计数误差）。n6.7.6.2 在在48h点计细菌，点计细菌，72h点计点计霉菌时，菌落极小不易辨认，需延霉菌时，菌落极小不易辨认，需延长培养时间长培养时间47天，再点计菌落数。天，再点计菌落数。n6.7.6.3 对有疑议的供试品以对有疑议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。周

41、再点计菌落数。n6.7.7 供试品按营养琼脂平板点计供试品按营养琼脂平板点计细菌菌落数；固体供试品按玫瑰红细菌菌落数；固体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌数，一般液体钠琼脂平板点计霉菌数，一般液体供试品按玫瑰红钠平板点计霉菌及供试品按玫瑰红钠平板点计霉菌及酵母菌总数；含蜂蜜及王浆的合剂酵母菌总数；含蜂蜜及王浆的合剂按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落数，按数，按YPD琼脂平板点计酵菌落数，琼脂平板点计酵菌落数，二者合并为霉菌及酵母菌数。二者合并为霉菌及酵母菌数。n6.8 菌落数报告规则菌落数报告规则:n6.8.1 细菌数选取平均菌落数在细菌数选取平均菌落数在30300之

42、间的稀释级，霉菌、酵母菌数之间的稀释级，霉菌、酵母菌数选取平均菌落数在选取平均菌落数在30100之间的稀之间的稀释级作为报告菌数的依据。释级作为报告菌数的依据。n如只有如只有1个稀释级平均菌落数在此个稀释级平均菌落数在此30300（30100）之间，则将该稀）之间，则将该稀释级的菌落计数器乘以稀释倍数报告释级的菌落计数器乘以稀释倍数报告（见附表例（见附表例6.8.1）。）。 n6.8.2 如有如有2个相邻稀释级平均菌落个相邻稀释级平均菌落数在数在30300（30100）时，则按）时，则按比值计算。当比值比值计算。当比值2时，则以时，则以2个个稀释级的平均菌落数均值报告。当稀释级的平均菌落数均值

43、报告。当比值比值2时，则以低稀释级的平均时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见附表菌落数乘以稀释倍数报告（见附表附附6.8.3）。）。 比值比值= 高稀释级平均菌落数稀释倍数高稀释级平均菌落数稀释倍数 低稀释级平均菌落数稀释倍数低稀释级平均菌落数稀释倍数 n6.8.3 如有如有3个稀释级平均菌落数均个稀释级平均菌落数均在在30300 (30100)之间时，则以后之间时，则以后2个稀释级计算级间比值报告个稀释级计算级间比值报告(同同6.8.2)，(见附表例见附表例6.8.3)。n6.8.4 如各稀释级平均菌落数均在如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，则按最高稀释级）以上，则按

44、最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在各稀释级平均菌落数均在30以下，以下，则按最低稀释级平均菌落数乘以稀则按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告（见附表释倍数报告（见附表6.8.4）。）。n6.8.5 如各稀释级平均菌落数均不在如各稀释级平均菌落数均不在30300 (30100)之间，则以最接近之间，则以最接近30或或300（100）的稀释级平均菌落数的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告（见附表乘以稀释倍数报告（见附表6.8.5）。n6.8.6 如各稀释级的平均菌落数均无如各稀释级的平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均菌落数菌落生长或最低

45、稀释级平均菌落数小小于于1时，应报告菌落数为时，应报告菌落数为10个个/g或或ml（见附表例见附表例6.8.6）。如供试品原液）。如供试品原液平板均未生长霉菌及酵母菌，报告未平板均未生长霉菌及酵母菌，报告未检出霉菌及酵母菌检出霉菌及酵母菌/ml。n6.8.7 当各稀释级平均菌落数小于当各稀释级平均菌落数小于30时，如高稀释级平均菌落大于或时，如高稀释级平均菌落大于或等于低稀释级平均菌落数时，应以等于低稀释级平均菌落数时，应以培养基稀释法重新测定，按测定结培养基稀释法重新测定，按测定结果报告菌落数（见附表例果报告菌落数（见附表例6.8.7）。）。 n培养基稀释法测定培养基稀释法测定n培养基稀释法

46、：培养基稀释法：n取低稀释级供试液（原液或取低稀释级供试液（原液或1：10供试液）供试液）3份，每份各份，每份各1ml，分别注分别注入入5个或个或5个以上平皿中（每皿个以上平皿中（每皿0.2ml或或0.2ml），），每每1个平皿倾个平皿倾注营养琼脂培养基约注营养琼脂培养基约15ml，混匀，混匀，凝固后，倒置培养，计数。凝固后，倒置培养，计数。n5个或个或5个以上平板点计的菌落之个以上平板点计的菌落之和，即为每和，即为每1ml菌落计数器，共得菌落计数器，共得3 组数据。以组数据。以3份低稀释级供试液份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。告。n6.9 结果报告

47、结果报告n6.9.1 菌落数在菌落数在100以内时，以内时， 按实按实有数据报告。有数据报告。n6.9.2 菌落数大于菌落数大于100时，取两位有时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规效数字报告，第三位按数字修约规则处理。则处理。n6.10 复试复试 供试品细菌数、霉菌及供试品细菌数、霉菌及酵母数其中任一项一次检验不合格，酵母数其中任一项一次检验不合格，应重新取应重新取2倍包装量供试品，依法倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果作单项复试两份，以三次检验结果的均值报告。的均值报告。n7注意事项注意事项n7.1 供试品检验全过程必须符合无供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用

48、灭菌作具时，不菌技术要求。使用灭菌作具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口吹吸。吸管不得用口吹吸。n7.2 从供试品稀释至倾注琼脂培养从供试品稀释至倾注琼脂培养基操作应在基操作应在1h内完成，避免由于时内完成，避免由于时间过长导致菌细胞繁殖或死亡。间过长导致菌细胞繁殖或死亡。n7.3 供试液稀释及注皿时应取均匀的供试液稀释及注皿时应取均匀的供试液，以免造成实验误差。供试液，以免造成实验误差。n7.4 为避免细菌菌落蔓延生长，宜采为避免细菌菌落蔓延生长，宜采用下列方法处理：用下列方法处理：n7.4.1 开盖干燥开盖干燥 将已凝固的琼脂平板将已凝固的琼脂平

49、板开盖，倒置斜放于净化工作台上，开开盖，倒置斜放于净化工作台上，开机机12h后合盖，放入培养箱培养；后合盖，放入培养箱培养；n7.4.2 换陶瓦盖换陶瓦盖 将已凝固的琼脂平将已凝固的琼脂平板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。n7.4.3 加加TTC 于倾注培养基前，在于倾注培养基前，在每每1000ml营养琼脂内加入灭菌营养琼脂内加入灭菌1% TTC溶液溶液1ml（最终浓度为最终浓度为0.001%），），混匀后倾注平皿。混匀后倾注平皿。 n7.5 一般情况下，以营养琼脂平板计一般情况下，以营养琼脂平板计数细菌数，玫瑰红钠琼脂平板计数霉数细菌数，玫瑰红钠琼脂平板计数霉菌、酵

50、母菌数。在特殊情况下，如营菌、酵母菌数。在特殊情况下，如营养琼脂平板生长了霉菌、酵母菌，且养琼脂平板生长了霉菌、酵母菌，且多于玫瑰红钠琼脂平板的霉菌和酵母多于玫瑰红钠琼脂平板的霉菌和酵母菌菌落数，则营养琼脂平板的霉菌、菌菌落数，则营养琼脂平板的霉菌、酵母菌数报告；反之，如玫瑰红钠琼酵母菌数报告；反之，如玫瑰红钠琼脂平板生长了细菌，且多于营养琼脂脂平板生长了细菌，且多于营养琼脂平板的细菌菌落数，则以玫瑰红钠琼平板的细菌菌落数，则以玫瑰红钠琼脂平板的细菌数报告。脂平板的细菌数报告。n如营养琼脂平板生长的霉菌、酵母如营养琼脂平板生长的霉菌、酵母菌数或玫瑰红钠琼脂平板生长的细菌数或玫瑰红钠琼脂平板生长