分析方法在中药药代动力学研究中的应用课件.ppt
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1、LOGO分析方法在中药药代动力学分析方法在中药药代动力学研究中的应用研究中的应用药物分析药物分析 任恒鑫任恒鑫中医中药历史悠久中医中药历史悠久现代医学如何解开中药体内过程的奥秘?现代医学如何解开中药体内过程的奥秘?中药药代动力学中药药代动力学中药药代动力学研究中药药代动力学研究血药浓度法血药浓度法中药药代动力学中药药代动力学生物效应法生物效应法药理效应法药理效应法药物累积法药物累积法微生物指标法微生物指标法 血药浓度法:血药浓度法: 该研究方法与化学药物的药代动力学研究原该研究方法与化学药物的药代动力学研究原理、方法相似。是以一种或几种药理作用明理、方法相似。是以一种或几种药理作用明确,结构已
2、知的有效成分为指标,测定该成确,结构已知的有效成分为指标,测定该成分在血液或其他生物组织中的浓度随时间变分在血液或其他生物组织中的浓度随时间变化过程,求出药代动力学参数,拟合药一时化过程,求出药代动力学参数,拟合药一时曲线,确定药代动力学模型,以此来反映中曲线,确定药代动力学模型,以此来反映中药及复方的药代动力学特征。药及复方的药代动力学特征。血药浓度与中药药代动力学参数血药浓度与中药药代动力学参数测定中的应用示例测定中的应用示例离子对反相高效液相色谱法测定兔血离子对反相高效液相色谱法测定兔血浆中氧化苦参碱含量浆中氧化苦参碱含量 氧化苦参碱氧化苦参碱(oxymatrine)是从豆科植是从豆科植
3、物苦参物苦参(Sophora. flavescens Ait)、苦豆子苦豆子(S.alopecuroideL.)及广豆根)及广豆根(S.subprostrata Chunet TChen)中提中提取分离而得到的一种生物碱,是这几取分离而得到的一种生物碱,是这几种常用中草药的主要有效成分。种常用中草药的主要有效成分。 作者首次采用离子对反相高效液相作者首次采用离子对反相高效液相色谱法,以非那西丁为内标物测定色谱法,以非那西丁为内标物测定了血浆中氧化苦参碱的浓度,并对了血浆中氧化苦参碱的浓度,并对氧化苦参碱在家兔体内的药代动力氧化苦参碱在家兔体内的药代动力学进行了研究。学进行了研究。1方法与结果方
4、法与结果(1)色谱条件:色谱条件:色谱柱色谱柱:DiamonsilTMC18柱柱(200mmX4.6mmI.D.,5m)流动相:乙腈流动相:乙腈-水水(20:80,V/V,含庚烷磺酸钠,含庚烷磺酸钠5mmolL,磷酸调磷酸调Ph3.2)。柱温:柱温:40。流速:流速:1.0mlmin。检测:紫外检测器,检测:紫外检测器,220nm波长处。波长处。灵敏度:灵敏度:0.01AUFS。进样量:进样量:1l。 (2)血浆样品处理:血浆样品处理: 精密吸取血浆精密吸取血浆0.4ml,置于,置于5ml具塞离心管中,具塞离心管中,依次加入重蒸馏水依次加入重蒸馏水0.2ml,内标溶液,内标溶液100 l,6H
5、ClO40.4ml,旋涡混合,旋涡混合30s,离心,离心(10000r/min)5min,上清液转移至,上清液转移至10ml离心管离心管中,加中,加5mol/LNaOH溶液溶液0.4ml,氯仿,氯仿-正丁醇正丁醇(98:2,v/v)提取溶液提取溶液4ml,旋涡混合,旋涡混合lmin,离,离心心(4000r/min)10min。吸取下层有机相,。吸取下层有机相,40水浴氮气吹干,残渣用水浴氮气吹干,残渣用200l流动相溶解,旋流动相溶解,旋涡混合涡混合30s,离心,离心(15000r / min) 5min。取上清。取上清液液1l进样,记录色谱图。进样,记录色谱图。 (3)专属性:专属性: 在实
6、验条件下,血浆中杂质不干扰样品及内标物的测定,氧化苦参碱及内标在实验条件下,血浆中杂质不干扰样品及内标物的测定,氧化苦参碱及内标物的保留时间分别为物的保留时间分别为6.5min和和20.2min,二者能够完全分离,二者能够完全分离.(4)标准曲线与线性范围:标准曲线与线性范围: 以待测物浓度为横坐标,待测物与内标物以待测物浓度为横坐标,待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标,用加权最小二乘的峰面积比值为纵坐标,用加权最小二乘法进行回归运算,法进行回归运算,求得直线回归方程为求得直线回归方程为: y=0.01358+0.18728X,r=0.9965。线性范围为线性范围为: 0.5100mgL。(5
7、)准确度与精密度:准确度与精密度:准确度与精密度数据如下准确度与精密度数据如下:RE为为-4.14.0;日内日内RSD6.7%,日间日间RSD13.9。(6)氧化苦参碱与内标非那西丁的萃取回收率:氧化苦参碱与内标非那西丁的萃取回收率:氧化苦参碱的萃取回收率为氧化苦参碱的萃取回收率为89.492.2,RSD3.8;内标非那西丁的萃取回收率为内标非那西丁的萃取回收率为90.7, RSD3计。计。 (5)回收率:回收率: 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚相对回收率芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚相对回收率为为94.6102.4,RSD为为1.85.5,n=5;萃;萃取回收率为取回收率为69.65
8、76.69(芦荟大黄素芦荟大黄素74.91,75.70,75.08;大黄酸;大黄酸75.58,76.50,76.69;大黄素;大黄素73.22,75.76,76.43;大黄;大黄酚酚70.05,69.65,72.45;内标;内标69.78,70.56,70.85)。 (6)精密度:精密度: 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚日内芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚日内RSD均均为为0.574.7(n=5);日间;日间RSD均为均为0.558.2(n=5)。 (7)大黄药材提取液与复方大黄药材提取液与复方WPY颗粒在大鼠颗粒在大鼠体内组织分布研究:体内组织分布研究:6只大鼠分别于灌胃后只大鼠分别于
9、灌胃后1,2,4,6,12h自股动脉取血,分取出心、肝自股动脉取血,分取出心、肝及肾组织,用枸橼酸盐缓冲液及肾组织,用枸橼酸盐缓冲液(pH6.2)冲洗干冲洗干净,滤纸吸干水分,称定重量。分别加枸橼净,滤纸吸干水分,称定重量。分别加枸橼酸缓冲液酸缓冲液2.0ml磨成匀浆,按照确定的方法进磨成匀浆,按照确定的方法进行处理和测定,测定结果表明含大黄的单、行处理和测定,测定结果表明含大黄的单、复方制剂中蒽醌类衍生物在大鼠体内的分布复方制剂中蒽醌类衍生物在大鼠体内的分布以肾脏半分布最高,血浆、心脏、肝脏中的以肾脏半分布最高,血浆、心脏、肝脏中的分布依次降低。分布依次降低。2.2.讨论讨论 (1)大黄蒽醌
10、类衍生物与葡萄糖醛酸结合成苷时为水溶大黄蒽醌类衍生物与葡萄糖醛酸结合成苷时为水溶性物质,而其蒽醌母核结构为脂溶性化合物,我们在建性物质,而其蒽醌母核结构为脂溶性化合物,我们在建立立HPLC法进行测定时,主要是对蒽醌苷元进行测定,法进行测定时,主要是对蒽醌苷元进行测定,因而应将水,溶性的苷水解成脂溶性的蒽醌衍生物。将因而应将水,溶性的苷水解成脂溶性的蒽醌衍生物。将苷水解为苷元的方法有酸水解、碱水解和酶水解等多种苷水解为苷元的方法有酸水解、碱水解和酶水解等多种方法,从易操作性和实验费用角度综合考虑,我们决定方法,从易操作性和实验费用角度综合考虑,我们决定从酸水解的角度来进行生物样品的预处理方法的考
11、察,从酸水解的角度来进行生物样品的预处理方法的考察,在综合考察水解方法、萃取溶剂种类、水解的温度、水在综合考察水解方法、萃取溶剂种类、水解的温度、水解用酸的种类、酸的浓度的基础上,决定选用解用酸的种类、酸的浓度的基础上,决定选用15的硫的硫酸水浴酸水浴(702)30min水解待处理的生物样品,使其水解待处理的生物样品,使其中的苷水解为苷元便于测定。中的苷水解为苷元便于测定。 (2)由大黄蒽醌衍生物结构可知,为具强紫由大黄蒽醌衍生物结构可知,为具强紫外吸收的脂溶性、弱酸性物质,在进行色外吸收的脂溶性、弱酸性物质,在进行色谱条件筛选时,选用可限制各组分离解的谱条件筛选时,选用可限制各组分离解的离子
12、抑制色谱法使各个组分均处于分子状离子抑制色谱法使各个组分均处于分子状态,从而使各个色谱峰之间达到基线分离态,从而使各个色谱峰之间达到基线分离且峰形对称。各成分的保留时间分别为:且峰形对称。各成分的保留时间分别为:芦荟大黄素:芦荟大黄素:7.11min;大黄酸:;大黄酸:8.06min;大黄素:大黄素:14.46mira内标:内标:15.97min;大黄;大黄酚:酚:20.16min。 (3)由于组织匀浆中含有大量的内源性物质,由于组织匀浆中含有大量的内源性物质,不能采用与血浆样品相同的预处理方法对组不能采用与血浆样品相同的预处理方法对组织样品进行处理。鉴于内源性物质大多具水织样品进行处理。鉴于
13、内源性物质大多具水溶性,我们在综合考察固相萃取及液一液萃溶性,我们在综合考察固相萃取及液一液萃取方法的基础上,选用乙醚萃取出待测物质,取方法的基础上,选用乙醚萃取出待测物质,再用水洗涤萃取物中的大量内源性物质,从再用水洗涤萃取物中的大量内源性物质,从而消除内源性物质对蒽醌类衍生物测定的干而消除内源性物质对蒽醌类衍生物测定的干扰扰中药代谢物研究中的应用示例中药代谢物研究中的应用示例液相色谱液相色谱- -质谱联用法质谱联用法(LC(LCMS)MS)示例液相色示例液相色谱谱- -串联质谱法鉴定大鼠血浆中的东莨菪串联质谱法鉴定大鼠血浆中的东莨菪碱及其代谢物碱及其代谢物v 东莨菪碱东莨菪碱(scopol
14、amine)是从茄科是从茄科植物颠茄植物颠茄(Atropa belladonna L.)、曼陀罗曼陀罗(Datura Stramonium L.)及及莨菪莨菪(Hyosyamus nigerL.)等分离等分离提取的一种托品烷类生物碱。提取的一种托品烷类生物碱。v 为全面阐明该药在大鼠体内的代为全面阐明该药在大鼠体内的代谢过程,本实验利用谢过程,本实验利用LC-MSn技技术,对服药后的大鼠血样进行了术,对服药后的大鼠血样进行了定性分析,鉴定出了原药及其定性分析,鉴定出了原药及其7种代谢物。种代谢物。1实验部分实验部分(1)色谱条件:色谱条件:Zorbax ExtendC18不锈钢色谱柱不锈钢色谱
15、柱(3.0mm100mm,3.5m)同种填料的色谱保护柱同种填料的色谱保护柱(2.1mm12.5mm,5m)。流动相:甲醇流动相:甲醇-2mmolL醋酸铵水溶液醋酸铵水溶液(以甲酸调节以甲酸调节pH3.5) (70:30,VV)。流速:流速:0.2mlmin。柱温:柱温:40。进样量:进样量:20l。 (2)生物样品的制备:生物样品的制备: 6只健康只健康Wister大鼠大鼠250g10g。大鼠禁食。大鼠禁食12h,按,按50mgkg灌胃给药东莨菪碱后,分别于灌胃给药东莨菪碱后,分别于15min、45min、2h、18h和和24h眼眶取血,肝素抗凝,以眼眶取血,肝素抗凝,以5000rmin离心
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