fv1000北京生命科学研究所课件.ppt

1、11激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜 光谱扫描型光谱扫描型 (倒置显微镜倒置显微镜)简易使用说明书简易使用说明书22启动系统显微镜镜下观察微分干涉差观察 荧光观察 取图的操作界面 如何取图平面单标 平面双标同步扫描方式 序列扫描方式 平面单标 微分干涉差扫描双标 光谱扫描 操作界面 图像分析打开文件 图像的叠加 比例尺的使用 图像的重建 图像的旋转 保存图像 保存到关闭系统附录 33. 打开计算机. 打开激光器.(打开钥匙开关.).多线氩离子 ( , , ) (打开电源开关后,打开钥匙开关.).氦氖绿 ( ) .氦氖红 ( ) 打开汞灯电源开关.登陆 系统.双击快捷方式： 打开 应用软件.*

2、系统软件的启动需要等待一定时间. : : 44 微分干涉差微分干涉差观观察察 .使用手控面板选择物镜. (参照 .).插入起偏镜.插入微分干涉滑块.点击软件中的图标.标本聚焦.按照的操作转换物镜的倍率之后，对：物镜各物镜对应的元件*进行操作.* 元件 .使用滑块控制卤素灯的光强. .检查滤色片转盘的位置是否为“” .如果不是,用手柄按下图标. 手控面板用此旋钮进行微分干涉法对比度的调节.55 荧荧光光观观察察 .使用手控面板选择物镜.点击软件中的图标.使用手控面板选择荧光滤色片. (参照 .).标本聚焦. .选择第步后,显微镜进入荧光观察状态. 注意此时汞灯的机械快门要打开. (建议通常机械快

3、门要放在关闭的位置 () .) .检查滑块是否拉出.关于荧光滤色片：蓝色激发绿色荧光（例：、等） ：绿色激发红色荧光（例：、等） .观察之前，检查汞灯的机械快门要放在开启的位置 ().66图像的拇指索引明场观察 (显微镜镜下观察) 荧光观察 (显微镜镜下观察) 染料选择光路图 取图条件的保存调出取图条件 设定扫描的按钮选择或每个通道的调节 共聚焦的孔径大小卤素灯的光强调节 方式图像显示窗口内存中所显示的文件扫描模式扫描速度像素数缩放和平移 激光输出的调节扫描的设定物镜聚焦时间间隔和时间计数(用于或扫描)扫描带宽选择77获取单张图像（平面）（荧光图像）例：绿色荧光染色（）点击软件中的按钮 关闭汞

4、灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤. 点击按钮.(关闭染料选择面板可以用按钮.)染料选择后的显示界面88扫描控制面板: 连续扫描: 停止扫描: 快速扫描(隔行扫描)1 探测器的灵敏度调节 (HV)2 共聚焦的孔径大小调节 (C.A.)3 激光输出的调节 (Laser) 123调节方法 (例: HV调节):点击滑块, HV直接提高 (或降低) 到指定的位置.点击此按钮 或者使用鼠标转轮进行微调.图像调节略述.点击 按钮开始扫描.调节绿色()图像.(图

5、像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 .).点击按钮停止扫描. (参照 .)99.选择, 并选择扫描速度.*随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用 方式. 更多的信息，参照附录.) .点击按钮取得一幅图像.点击按钮, “ ()” 界面就出现.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“”类型是 软件专用的图像格式.)专用的图形格式格式:创建“一个含 ( )的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.格式:创建单个的格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作. 1010获取单张图像（平面）（荧光图像） 例：绿色荧光（

6、 ）红色荧光（ ）二重染色同步扫描点击软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤. 点击按钮.(关闭染料选择面板可以用按钮.)染料选择后的显示界面1111扫描控制面板: 连续扫描: 停止扫描: 快速扫描(隔行扫描)1 探测器的灵敏度调节 (HV)2 共聚焦的孔径大小调节 (C.A.)3 激光输出的调节 (Laser) 123调节方法 (例: HV调节):点击滑块, HV直接提高 (或降低) 到指定的位置.点击此按钮 或者使用鼠标转轮进行

7、微调.图像调节略述.点击 按钮开始扫描.调节绿色( )图像和红色 ( )图像. (图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 .).点击按钮停止扫描. (参照 .)1212.选择, 并选择扫描速度.*随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用 方式. 更多的信息，参照附录.) .点击按钮取得一幅图像.点击按钮, “ ()” 界面就出现.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“”类型是 软件专用的图像格式.)专用的图形格式格式:创建“一个含 ( )的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.格式:创建单个的格式的文件,

8、方便进行移动和进行其它的操作. 1313获取单张图像（平面）（荧光图像） 例：绿色荧光（ ）红色荧光（ ）二重染色序列扫描 (这里介绍线序列扫描.)点击软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤. 点击按钮.(关闭染料选择面板可以用按钮.)染料选择后的显示界面1414.点击序列扫描,并选择线序列方式.点击 按钮开始扫描.调节绿色( )图像和红色 ( )图像. (图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 .).点击按钮停止扫描. (参照

9、 .)1 探测器的灵敏度调节 (HV)2 共聚焦的孔径大小调节 (C.A.)3 激光输出的调节 (Laser) 123调节方法 (例: HV调节):点击滑块, HV直接提高 (或降低) 到指定的位置.点击此按钮 或者使用鼠标转轮进行微调.图像调节略述1515.选择, 并选择扫描速度.*随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用 方式. 更多的信息，参照附录.) .点击按钮取得一幅图像.点击按钮, “ ()” 界面就出现.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“”类型是 软件专用的图像格式.)专用的图形格式格式:创建“一个

10、含 ( )的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.格式:创建单个的格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作. 1616获取单张图像（平面）（荧光图像微分干涉） 例：绿色荧光（）图像. 点击软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤. 点击按钮. (关闭染料选择面板可以用按钮.). 选择.染料选择后的显示界面1717扫描控制面板: 连续扫描: 停止扫描: 快速扫描(隔行扫描)1 探测器的灵敏度调节 (HV)2 共聚焦的孔径大小调节

11、 (C.A.)3 激光输出的调节 (Laser) 123调节方法 (例: HV调节):点击滑块, HV直接提高 (或降低) 到指定的位置.点击此按钮 或者使用鼠标转轮进行微调.图像调节略述.点击 按钮开始扫描. .调节绿色 ()图像和微分干涉差的图像.(图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 .).点击按钮停止扫描. (参照 .)1818. 选择, 并选择扫描速度.*随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用 方式. 更多的信息，参照附录.) .点击按钮取得一幅图像.点击按钮, “ ()” 界面就出现.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存

12、为保存该幅图像.(保存为“”类型是 软件专用的图像格式.)专用的图形格式格式:创建“一个含 ( )的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.格式:创建单个的格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作. 1919 和 按钮: 点击移动.: 点击移动. 获取图像() (荧光图像) 例: 绿色荧光()和红色荧光 ()双标这里介绍线序列扫描取图的过程.采用和页步骤到.输入大小(点击按钮可以使用推荐的值), 并选择 .点击 按钮开始扫描.点击 和 按钮上移焦点位置. (参照.).当图像显示到达上限时, 点击 按钮确定.点击 和 按钮下移焦点位置. (参照.).当图像显示到达下限时, 点击 按钮确定.

13、点击按钮停止扫描.确定轴的上限和下限如下.2020.选择, 并选择扫描速度.*随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用 方式. 更多的信息，参照附录.) .选择按钮.点击按钮取得图像.点击按钮, “ ()” 界面就出现.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“”类型是 软件专用的图像格式.)专用的图形格式格式:创建“一个含 ( )的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.格式:创建单个的格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作. 2121*可以通过调用扫描状态来实现该设置. 更多的信息, 参照附录. 获取光谱图像

14、 () 例: 绿色荧光( )和绿色荧光 ()双标. 点击软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. . 点击按钮 检查光路. 做如下设置.选择 或 .选择作为激发光源.选择 .只选择.2222.点击按钮 , 出现光谱设置窗口.设置光谱带宽为 , 以此 为例.(参照附录关于改变光谱带宽的方法.) .点击 按钮开始扫描.在观察图像的同时, 移动光谱带到图像最亮的位置状态.(参照附录关于改变光谱带宽的方法.)注:移动光谱带位置要保持光谱 带宽为 不变.调节图像.(参照附录.) .点击按钮停止扫描.2323.选择, 并选择扫描速度.*随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下,

15、 背景噪音就会消除.(也可以使用 方式. 更多的信息，参照附录.) .设定要扫描的波长范围, 光谱带宽 和步距. 开始波长 结束波长 光谱带宽 步距.选择按钮.点击按钮取得图像.点击按钮, “ ()” 界面就出现.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“” 和类型是 软件专用的图像格式.)2424.双击资源管理器中要选择打开的文件. 显示状态的切换1:1显示帧的播放选择结束帧投影的切换3D重建放大调整窗口的大小动画播放速度选择开始帧文本不同形状的ROI区域网格箭头比例尺点颜色条Ch1 displayCh2 display 点击按钮 转换显示模式2525.

16、点击按钮 并选择 .要保存此图像, 右击此图像, 选择 并命名.2626.点击按钮 .点击图像的同时, 拖放此比例尺到一个特定的位置.点击手柄的左端或右端, 移动鼠标.选择比例尺并右击选择属性的设置.设置具体的比例尺属性.改变比例尺的大小改变文本, 颜色, 字体等.2727以一定的角度观察图像观察图像的某个横截面.点击按钮 .创建图像.拖动鼠标以一定的角度观察图像.要保存此图像, 进行下一页第步的 操作. .点击按钮 并选定 .拖动鼠标观察某个垂直横断面.要保存此图像, 进行下一页第步的 操作.2828保存上一页中第、选项的图像.点击按钮 .会创建一个图像 (带文件名).保存该幅图像:右击图像

17、管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“”类型是 软件专用的图像格式.)专用的图形格式格式:创建“一个含 ( )的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.格式:创建单个的格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作. 2929动画的播放.点击按钮 .创建图像.拖动鼠标以一定的角度观察图像.点击并控制按钮 实现图像围绕着 轴旋转.再次点击停止旋转.点击并控制按钮 实现图像围绕着 轴旋转.再次点击停止旋转.点击并控制按钮 实现图像围绕着 轴旋转.再次点击停止旋转.3030要保存动态旋转的图像, 请参照 如下的方法创建3D图像.例, 试图旋转图像180度. .点击按钮 .点击 菜

18、单.选择旋转轴.输入旋转的角度.选择类型并点击按钮. .输入一个文件名并点击按钮. 开始角度 结束角度 旋转速度 单次旋转的角度3131基于图像中类似荧光光谱相连的原则, 通过已知的每种荧光染料的定位分解光谱并得到图像.例:绿色荧光( )和绿色荧光 ()双标 此处显示分解光谱的通道分配.打开一幅 和 双标的图像.分别为 和 选定一个封闭的区域.从下拉菜单中选择 图标.双击和区域.检查处理类型设置为 “”并且 点击按钮.获得图像.3232记载的荧光光谱在此显示.从单标记的图像中取出单个荧光光谱作为参照, 进行光谱的分解并得到图像.例:绿色荧光( )和绿色荧光 ()双标.打开一幅 单标取样 的图像

19、.为 选定一个封闭的 区域.从下拉菜单中选择 图标.双击区域.点击 图标.输入保存的名字并且点击按钮将 的光谱记载到数据库中.对于单标, 重复步.3333 此处显示分解光谱的通道分配.打开一幅 和 双标的图像.从下拉菜单中选择 图标.双击数据库中记载的 和 图标.检查处理类型设置为 “”并且 点击按钮.获得图像.3434基于图像中类似荧光光谱相连的原则, 通过已知的一定数量的荧光标记分解光谱并得到图像.例: 两种类型荧光标记的样品 此处显示分解光谱的通道分配.打开一幅具有两种类型荧光标记的图像.从下拉菜单中选择 图标.选中两个检查框用于计算.(具有三种类型荧光标记时要选中 三个检查框.).检查

20、处理类型设置为 “”并且 点击按钮.获得图像. 3535或者图像的每个通道存为 格式的文件.右击图像管理器中显示的图像图标, 选择另存为保存该幅图像.设置 类型为 并保存.* 存为 和 格式也可以.*或者通道合并的图像存为 格式的文件带有比例尺的图像存为格式的文件.右击图像管理器中显示的图像图标, 选择另存为保存该幅图像.设置 类型为 并保存.检查要合并的通道并保存.* 存为 和 格式也可以.右击该幅图像.选择 并以新的文件名 保存该幅图像.动态图像存为格式的文件.右击该图像.选择 并以新的文件名 保存该图像.3636.插入一张光盘.点击.选择文件并拖放到的窗口.点击 .点击.开始刻录.点击按

21、钮结束.3737.选择, 退出软件.退出 .()选择 . ()在 窗口中,选择 并点击按钮.关闭激光器.(关闭钥匙开关.).多线氩离子 ( , , ) (等待风扇停止,关闭电源开关.).氦氖绿 ( ) .氦氖红 ( ) .关闭汞灯电源.3838激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜 光谱扫描型光谱扫描型 (倒置显微镜倒置显微镜)附录附录3939 共聚焦的原理和调节原理: 探测器灵敏度的调节 ()给定值 灵敏度 图像亮度 (注意背景噪音变得突出.)* 推荐值为或以下. 按钮: 改变电压以为一个单位 (投射光通道设定为)调节 ()给定值 图像亮度 依照放大率的变化, 图像变得更亮. 按钮: 改变增益以

22、为一个单位 调节 ()给定值 图像亮度 按钮: 改变增益补偿以为一个单位C.A.: 共聚焦孔径大小的调节 (m)给定值 C.A. 大小 图像亮度 (注意光学切片的厚度变大.)* 推荐使用Auto设置.经过调节C.A.要恢复初始值, 再次点击Auto. 按钮: 改变孔径大小以1m为一个单位.M_Ar or HeNeG, HeNeR:激光输出强度的调节 (%)给定值 输出强度 图像亮度 (注意荧光漂白变得明显.)* 激光输出强度尽量要小. 按钮: 改变输出强度以1%为一个单位.Memo共聚焦孔径大小、光学切片厚度和图像亮度的关系C.A.Optical slicethicknessImagebrig

23、htnessM_ArPMTImagebrightness激光输出强度、探测器灵敏度和图像亮度的关系4040 获取图像如何降低背景噪音 降低扫描速度通过降低扫描速度探测器从开始检测就 忽略背景噪音.优点:相比Kalman方式, 能够取到更锐的图.缺点:单次扫描的速度很慢.1. 选择扫描速度.*Auto ON:扫描速度变慢时, 背景噪音被去除而图像亮度不变.Auto OFF: 扫描速度变慢时, 背景噪音被去除而图像亮度增加.Kalman方式通过重复获取一定数量的图像进行平均算法运算处理. 从而去除背景噪音和粗糙度.优点:单次扫描的速度很快.缺点:由于图像平均而图像模糊.1. 点击Kalman并选择Line或Frame方式.2. 输入累计数字(扫描的次数).