聚合酶链反应(PCR)技术的基本原理及检测技术课件.pptx

1、内容概要内容概要n 概念和历史概念和历史n 原理与体系原理与体系n 分类特点分类特点n 注意事项注意事项是一个在是一个在体外（？）体外（？）特异特异地地复制复制一段一段已知已知/ /未知未知序列序列的的DNADNA片片段的过程，这项技术使人们段的过程，这项技术使人们快速快速从试管中从试管中获获得大量拷贝的得大量拷贝的特异特异核酸片段核酸片段快速特异快速特异扩增扩增得到大量核酸得到大量核酸叩响生命之门叩响生命之门发现发现DNADNA双螺旋后双螺旋后6767年大事纪年大事纪 沃森和克里克在沃森和克里克在自然自然杂志杂志发表文章提出发表文章提出DNADNA双螺旋结构，双螺旋结构，开启了分子生物学的辉

2、煌时代开启了分子生物学的辉煌时代 科学家们先后确认了人体共有科学家们先后确认了人体共有2323对染色体对染色体，并发现了首个因，并发现了首个因为染色体缺陷导致的疾病为染色体缺陷导致的疾病- -唐氏综合症。随后唐氏综合症。随后DNADNA的复制以及其的复制以及其传递信息的方式被发现传递信息的方式被发现 19701970年，年，限制性内切酶限制性内切酶的发现使得基因重组技术得以发展，从此的发现使得基因重组技术得以发展，从此打开了打开了基因工程基因工程的大门。应用克隆转化的技术，成功生产出单克隆的大门。应用克隆转化的技术，成功生产出单克隆抗体，并应用于胰岛素的制备抗体，并应用于胰岛素的制备基因技术快

3、速发展的阶段，先后出现基因技术快速发展的阶段，先后出现基因指纹基因指纹技术、技术、基因复基因复制制技术、技术、DNADNA重组重组技术、基因组图谱等技术、基因组图谱等 19901990年，人类基因组计划正式启动年，人类基因组计划正式启动19971997年，诞生了世界上第一只克隆动物年，诞生了世界上第一只克隆动物- -多莉羊多莉羊20002000年，人类基因组图谱绘制年，人类基因组图谱绘制20012001年，人类蛋白组图谱启动年，人类蛋白组图谱启动20022002年，年，疟原虫及蚊的基因图谱，水稻和小鼠的基因图谱疟原虫及蚊的基因图谱，水稻和小鼠的基因图谱 蛋白质图谱的绘制等也陆续展开，基因芯片，

4、蛋白质图谱的绘制等也陆续展开，基因芯片， 二代测序和高通量测序技术、全基因组扫描等不二代测序和高通量测序技术、全基因组扫描等不 断完善，蛋白和转录组学等断完善，蛋白和转录组学等20152015年，年，奥巴马提出精准医疗奥巴马提出精准医疗20202020年，年，SARS-COV2SARS-COV2病毒大流行核酸确定为病毒大流行核酸确定为诊断金标准诊断金标准中心法则中心法则基因组基因组转录组转录组蛋白组蛋白组 DNA DNAProteinProteinGenomeGenomeProteomemRNAmRNATranscriptome 遗传遗传信信息息载载体体功能功能执执行体行体逆转录逆转录转录转录

5、翻译翻译 Gene一一 mRNA Protein Metabolite系系统统生生物物学学 “Jolies mother, actress and producer, died of ovarian cancer in 2007 at the age of 56. She underwent further operation on her ovary and ovarian ducts very recently. BRAC1 Angelina JolieAngelina Jolie( (安吉丽娜安吉丽娜朱莉朱莉) ) Undergoes Undergoes double mastectom

6、y double mastectomy 05/15/2013 CNN.com05/15/2013 CNN.com个性化医疗个性化医疗/ /精准医疗的标志性事件精准医疗的标志性事件Genetic risk 87% risk-breast cancer50% risk -ovarian cancer, Michael SmithPrize share: 1/21990William Allan Memorial Award of the American Society of Human GeneticsPreis Biochemische Analytik of the German Socie

7、ty of Clinical Chemistry and Boehringer Mannheim1991National Biotechnology AwardGairdner AwardR & D Scientist of the Year1992California Scientist of the Year Award1993Nobel Prize in ChemistryJapan PrizeThomas A. Edison Award1994Honorary degree of Doctor of Science from the University of South Caroli

8、na1998Inducted into the National Inventors Hall of FameRonald H. Brown American Innovator Award2004Honorary degree in Pharmaceutical Biotechnology from the University of Bologna, Italy2008BayBio Lifetime Achievement Award San Francisco, CaliforniaAwards and Honors发现发现PCRPCR的历程的历程DNADNA的复制的复制核酸体外扩增的设

9、想核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明聚合酶链反应的发明 19711971年，年，KhoranaKhorana提出：经提出：经DNADNA变性，与变性，与合适引物杂交，用合适引物杂交，用DNADNA聚合酶延伸，并聚合酶延伸，并不断重复便可克隆不断重复便可克隆tRNAtRNA基因基因 但由于当时测序和引物合成的困难，但由于当时测序和引物合成的困难，KhoranaKhorana的设想被人们的设想被人们遗忘遗忘了了 一步之遥错失一步之遥错失发现发现PCR的历程（的历程（1）KhoranaKhorana错失机遇错失机遇Mullis (1944-2019)，1983年春夏之交的一个晚上，在Cetus公司

10、工作期间，他开车去乡下别墅的路上萌发了用引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法突发奇想成大事很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一是其中之一发现发现PCR的历程（的历程（2） 1983年，年，Mullis跟女友开车到乡下度假途中跟女友开车到乡下度假途中 瞬间感觉瞬间感觉两排路灯两排路灯就是就是DNA的两条链的两条链 自己的自己的车车和对面开来的车：和对面开来的车：DNA聚合酶聚合酶 面对面地合成着面对面地合成着DNA， Mullis的第一个的第一个PCR实验实验 1983年年9月，月，Mullis在反应体系在反应体系中加入中

11、加入DNA聚合酶后在聚合酶后在37一一直保温。结果电泳上没有何条带。直保温。结果电泳上没有何条带。 于是他用加热来解链，每次解链于是他用加热来解链，每次解链后再加入后再加入DNA聚合酶，依次循聚合酶，依次循环。环。1983年年12月，他终于看到了月，他终于看到了被同位素标记的被同位素标记的PCR条带条带PCR技术的创建（技术的创建（3）发现PCR的历程（4） 1983年, Kary B. Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得以实现 1988年Saiki等，引入Taq酶技术 1989年，Science杂志列PCR 为十项重大科学发明之首,1989年为PCR爆炸年 1993年，M

12、ullis获1诺贝尔化学奖 2019年8月7日，Mullis仙逝，享年75岁内容概要内容概要n 概念历史概念历史n 原理体系原理体系n 分类特点分类特点n 注意事项注意事项二、二、PCR技术的原理及反应体系技术的原理及反应体系1. PCR技术的基本原理技术的基本原理最早称之为：无细胞分子克隆法最早称之为：无细胞分子克隆法 在微量离心管中，加入适量的缓冲液，微量的模板DNA，四种dNTP，DNA多聚酶，一对引物（物质基础） 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍（反应过程） 一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍；扩增了特异区段的DNA带

13、（结果） 1 12 23 34 45 52222555572729494时间（时间（minmin）温度温度（）2. PCR的反应过程的反应过程适温延伸适温延伸3 3高温变性高温变性1 1低温退火低温退火2 2重复重复1313步步25302530轮轮目的目的DNADNA片段片段扩增扩增100100万倍以上万倍以上DNADNA双螺旋双螺旋DNADNA单链单链与引物复性与引物复性DNADNA变性变性形成形成2 2条单链条单链子链延伸子链延伸DNADNA加倍加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1 12 23 34 45 52222555572729494时间（时间（minmin）温

14、度温度（）适温延伸适温延伸3 3高温变性高温变性1 1低温退火低温退火2 2重复重复1313步步25302530轮轮目的目的DNADNA片段片段扩增扩增100100万倍以上万倍以上DNADNA双螺旋双螺旋DNADNA单链单链与引物复性与引物复性子链延伸子链延伸DNADNA加倍加倍DNADNA变性变性形成形成2 2条单链条单链模板模板DNADNA9595PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点5656引物引物1 1引物引物2 2DNADNA引物引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物引物1 1引物引物2 2DNADNA引物引物7272TaqTaq酶酶TaqTaq酶

15、酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点7272第第1 1轮结束轮结束第第2 2轮开始轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9595TaqTaqTaqTaqTaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点7272第第2 2轮结束轮结束3. 3. PCR技术的特点技术的特点u高度的高度的灵敏性灵敏性3030轮循环轮循环 扩增量达扩增量达230个拷贝（个拷贝（109拷贝）拷贝）PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍皮克皮克(pg=10-12)甚至甚至单个拷贝单个拷贝扩增到微克扩增到微克( g=10-6)水平水平 u 高特异

16、性高特异性引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键引物设计的最重要原则： 最大限度地提高扩增效率和特异性； 同时尽可能减少非特异性扩增PCR技术的特点技术的特点 应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列 引物长度以15-40 bp为宜 碱基尽可能随机分布，G+C占50-60% 引物内部避免形成二级结构 两引物间避免有互补序列 引物3端为关键碱基；5端无严格限制引物设计原则引物设计原则3 限制性内切酶的限制性内切酶的识别识别序列序列 启动子序列启动子序列 定点突变定点突变 探针探针标记标记u 操作简便易行操作简便易行 PCR扩增法，只需数小时，就可用电泳法检出1g基因组DNA中仅

17、含数个拷贝的模板序列 传统的DNA 扩增法是分子克隆法，首先要构建含有目的基因的载体，然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选；这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程，操作复杂，一般需要数天到数周时间PCR技术的特点技术的特点 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA，如新冠病毒RNA的检测，有些试剂盒可以无须抽提直接检测u 对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低PCR技术的特点技术的特点4. PCR的反应体系和注意事项的反应体系和注意事项 PCR经（1）高温变性、（2）低温退火和（3）中温延 伸三步， Tap多聚酶以dNTP为原料，以引物为复制的

18、起 点，合成新链如此重复循环,经每次拷贝数放大一倍的 2030次循环，待测基因片段放大了数百万倍 扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯下肉眼 能见到扩增特异区段的DNA带/或者其它检测技术进行 后续分析和研究PCRPCR的反应体系的反应体系总体积总体积1100lBuffer缓冲液缓冲液dNTP原料原料Primer引物引物DNA分子分子 模板模板 TaqDNA聚合酶聚合酶 PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程(1)(1)模板模板DNA dNTP 引物引物Buffer预变性预变性模板模板DNA dNTP 引物引物Buffer94oC5min基本过程基本过程PCRPCR技术的基本过程技术的

19、基本过程(2)(2)PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程(3)(3)测序测序酶切克隆酶切克隆DNA/RNA/DNA/RNA/蛋白杂交蛋白杂交小分子探针小分子探针.PCRPCR反应体系中的成分反应体系中的成分 单、双链DNA均可 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类 一般1-100ng DNA模板/100L 模板浓度过高会导致非特异性增加 过低，无扩增，假阴性模板模板 提取的核酸即可作为模板用于PCR反应 临床检测标本，也可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增 RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防

20、止RNase降解RNA引物浓度引物浓度 通常10-100pmol/L 过高，易导致模板与引物错配，特异性下降 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计合适的引物，用 PCR就在体外大量扩增 注意引物聚合体的影响 0.5-2.5 U/50 l 两种Taq DNA 聚合酶 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 一个 PCR反应约需酶量 2.5U/100 l 过高，非特异性扩增；过低，产物量减少TaqTaq DNADNA聚合酶聚合酶 dNTP 所需浓度取决于需要扩增片段的长度 一般用等浓度的四种dNTP混合 过高，易产生错误碱

21、基的掺入 过低，降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降, 影响DNA聚合酶的活性dNTP的质量与浓度的质量与浓度与与 PCR扩增扩增效率效率有密切关系有密切关系 dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，缓冲液调pH到7.0-7.5，小量分装，-20冻存，避免多次冻融 扩增体系中dNTP应为50-200mol/L，等摩尔配制 ， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），易引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂0.5mmol/

22、L-2.5mmol/L反应体系Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度（1）变性双链DNA解链为单链：温度：94oC 20-30秒（2）退火退火：温度由引物长度和GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合; 降低温度可增加反应的灵敏性（3）延伸延伸时间由扩增片段长度决定 温度：70-75,一般为72（4）循环次数循环次数：主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加 循环参数循环参数非一成不变，科学和灵活的应用

23、循环参数非一成不变，科学和灵活的应用经典循环参数（经典循环参数（500bp500bp以内）以内）94 30s 55 45s72 1min94 5min30次72 7min42 forever5）PCR反应条件的选择反应条件的选择PCR反应条件包括反应条件包括: 温度温度 时间时间 循环次数循环次数温度与时间的设置温度与时间的设置 设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应：三温度点法：- 9095模版变性- 40 60引物退火并结合到靶序列上，- 7075 模板延伸 二温度点法：对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸变性

24、温度与时间变性温度与时间： 变性温度低低，解链不完全是导致失败的最主要原因 一般9394 l min足以使模板DNA变性- 若低于93则需延长时间- 但温度不能过高，因为高温对酶的活性有影响- 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，可能会导致PCR失败或者效率降低 退火温度退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至4060，引物和模板结合 退火温度与时间，取决于引物长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想 退火退火( (复性复性) )温度与时间：温度与时间： Tm值（解链温度） 指把DN

25、A的双螺旋结构解链一半时的温度，亦即变性时， 紫外吸收值达到最大值的50%时的温度 。当核酸达到Tm值 时，其260nm吸收量可增加百分之四十 长度低于25mer的引物：Tm=4oC（G+C）2oC（A+T） 更长的引物：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10Na+ + 0.41 (%GC)600/size Tm值内，较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间：一般30-60秒，足以使引物与模板之间完全结合可通过以下公式帮助选择引物的退火温度引物的退火温度延伸温度与时间延伸温度与时间 Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70-80 150核苷

26、酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/S/酶分子 高于90时，DNA合成几乎不能进行延伸温度与时间延伸温度与时间 延伸温度：一般在7075，常用温度为72，过高不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 34kb的靶序列需34min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些循环次数 循环次数 决定PCR扩增程度 循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在3040次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多内容概要内容概要 概念

27、历史概念历史 原理体系原理体系 分类特点分类特点 注意事项注意事项三、常见的三、常见的PCR技术技术名名 称称主要用途主要用途简并引物扩增法简并引物扩增法扩增未知基因片断扩增未知基因片断巢式巢式PCR提高提高PCR敏感性、特异性，分析突变敏感性、特异性，分析突变复合复合PCR同时检测多个突变或病原同时检测多个突变或病原反向反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变单一特异引物单一特异引物PCR扩增未知基因组扩增未知基因组DNA单侧引物单侧引物PCR通过已知序列扩增未知通过已知序列扩增未知cDNA锚定锚定PCR分析具备不同末端的序列分析具备不同末端的序

28、列增效增效PCR减少引物二聚体，提高减少引物二聚体，提高PCR特异性特异性固着固着PCR有利于产物的分离有利于产物的分离基于扩增基础的分子诊断技术及其应用基于扩增基础的分子诊断技术及其应用 1983年后的37年里，扩增DNA的技术成为分子诊断应用最广的技术之一，发展变化了数十种核酸扩增检测技术 根据DNA被扩增的过程中是变温还是恒温方式，可以将核酸扩增技术分为两类， 温度循环式的扩增技术，常规PCR和实时定量PCR（RTQ-PCR） 等温方式的扩增技术，以核酸序列扩增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、转录介导的扩增（Trans

29、cription-mediated amplification，TMA），环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等技术为主。 一、温度循环式的扩增技术 常规常规PCR：反应结束后对产物进行电泳、杂交、测序等方式分析，常与其他技术的结合衍生出多种分析方法，如：结合限制性长度多态性（PCR-RFLP）、结合特异性寡合苷酸探针 斑点杂交（PCR-ASO）、结合变性梯度凝胶（PCR-DGGE）、 结合单链构象多态性（PCR-SSCP）等分析技术 RT-PCR：病原体的多重PCR（Multiplex PCR），提高敏感性和 特异性的巢式P

30、CR（nested PCR），研究基因表达的原位 PCR （in situ PCR），分析RNA的逆转录PCR（RT-PCR）以及锚定PCR、 不对称PCR、膜结合PCR等等名称名称主要用途主要用途膜结合膜结合PCR去除污染的杂质或去除污染的杂质或PCR产物残留产物残留表达盒表达盒PCR产生合成或突变蛋白质的产生合成或突变蛋白质的DNA片断片断连接介导连接介导PCRDNA甲基化分析、突变和克隆等甲基化分析、突变和克隆等RACE-PCR扩增扩增cDNA末端末端定量定量PCR定量定量mRNA或染色体基因或染色体基因原位原位PCR研究表达基因的细胞比例等研究表达基因的细胞比例等臆断臆断PCR鉴定细菌

31、或遗传作用鉴定细菌或遗传作用通用引物通用引物PCR扩增相关基因或检测相关病原扩增相关基因或检测相关病原信使扩增表型分型信使扩增表型分型同时分析少量细胞的同时分析少量细胞的mRNA荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法I. 普通荧光定量PCR常用的荧光标记方法可简单分为两大类常用的荧光标记方法可简单分为两大类： 非特异检测非特异检测双链DNA内插式荧光染料 代表是SYBR Green 荧光染料 扩增序列扩增序列专一专一检测检测主要指荧光探针主要指荧光探针 TaqMan探针和分子信标Molecu

32、lar Beacon 荧光染料：荧光染料：成本低廉，实验设计简便 探针杂交：探针杂交：原理上严格，数据特异性高、更为精确 Real time PCRReal time PCR的特点的特点 在定性在定性PCRPCR技术上发展起来的技术上发展起来的核酸定量技术核酸定量技术 实现了对DNA模板的定量 而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强 能实现多重反应 让自动化程度成为可能 避污染性、具实时性和准确性等特点 Real time PCRReal time PCR利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩每一个循环扩增产物量的变化增产物量的变化，通过

33、，通过CtCt值值和和标准曲线标准曲线实现对实现对起始模板起始模板的的定量分析定量分析Opticon本底期、指数扩增期、平台期本底期、指数扩增期、平台期 69Real-time PCRReal-time PCR与普通与普通PCRPCR的区别的区别 可定量结果 采用闭管检测，不需PCR后处理，扩增和检测一次同时完成 不需开盖，不产生污染 探针与被检DNA序列特异杂交，增强了特异性 光谱分析仪直读结果，自动分析，增强了灵敏性和客观性Real time PCRReal time PCR原理原理荧光扩增曲线可以分成三个阶段三个阶段： 荧光背景信号阶段 荧光信号指数扩增阶段：PCR 产物量的对数值与起始

34、 模板量之间存在线性关系 平台期：关系复杂为了定量和比较的方便，在RT- PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值荧光阈值和 CT CT 值值Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/ - 0.04Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/ - 0.04C(t) value18.12 +/ - 0.04C(t) value18.12 +/ - 0.04 荧光阈值荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标 准(即PCR扩增产物量的标准) CtCt值中的值中的C C代表循环数代表循环数(C

35、ycle),t(Cycle),t代表阈代表阈(thres(threshold)hold) CtCt值的含义：值的含义：每个反应管内的荧光信号达到每个反应管内的荧光信号达到设定设定的阈值时所的阈值时所 经历的经历的循环数循环数 荧光信号荧光信号阈（threshold threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 真正的信号:荧光信号超过阈值为什么用为什么用CtCt值值定量而不用定量而不用终点终点相对荧光相对荧光强度强度定量定量 相同模板在同一台相同模板在同一台PCRPCR仪上相同条件下重复仪上相同条件下重复9696次扩增的扩

36、增曲线图次扩增的扩增曲线图CtCt值的重现性值的重现性 软件自动利用已知起始已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线.未知未知10410310610510210Real time PCRReal time PCR如何定量？如何定量？初始 DNA量越多, 荧光达到域值时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度Real time PCRReal

37、 time PCR荧光探针荧光探针非特异性标记非特异性标记 SYBR Green IRQ特异性的荧光探针特异性的荧光探针 Molecular Beacon TaqMan 非特异性标记：非特异性标记：SYBR Green I 扩增产物的荧光标记原理扩增产物的荧光标记原理5353SGSGSGSGSGExcitationEmission延伸结束，形成双延伸结束，形成双链链DNA，此时，此时sybr green结合到双螺旋结合到双螺旋小沟中，当受到适小沟中，当受到适合光源激发是，会合光源激发是，会发射出荧光检发射出荧光检测时机在延伸结束测时机在延伸结束时时SYBRGreenSYBR Green I 熔

38、解曲线分析熔解曲线分析温度温度荧光强度荧光强度Tm荧光强度的变化是由于温度不断升高，双链荧光强度的变化是由于温度不断升高，双链DNADNA解离，解离，SGISGI游离；游离；TmTm是熔解曲线的特征值是熔解曲线的特征值融解曲线的作用融解曲线的作用Non-specific productAmplicon 判断判断PCRPCR产物的特异性；产物的特异性； 排除非特异性扩增产物的干扰排除非特异性扩增产物的干扰茎由互补配对的序列组成茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对环与目标序列完全配对荧光基团荧光基团淬灭基团淬灭基团 分子信标分子信标（molecular beacon）是一类能形成发夹结构(或

39、者叫茎环结构)的探针，序列两末端序列互补（5-8bp左右），中间环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补。探针一端标记报告荧光基团，另一端结合淬灭基团 当探针游离呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，荧光基团激发的荧光能量被淬灭基团吸收而使检测探头无法检测到 当互补序列出现时，探针与DNA杂交，探针转变成一个开放的线性结构，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产从而产生可被检测到的荧光Molecular BeaconsMolecular Beacons SNPTACCGGGGGTTACGAACG GTAATTTTTGCCCCCAAAAQ荧光素荧光素目标序列目标序列茎茎淬灭剂淬

40、灭剂TaqManTaqMan探针法探针法 指扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光特异性的荧光探针探针：该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，3端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q） 与目标序列互补与目标序列互补 当探针完整的时候，5端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3端荧光基团淬灭，仪器检测不到5端报告基团所激发的荧光信号TaqmanTaqman技术原理技术原理reporterreporterquencherquencherTaq酶在链延伸时遇到与模板结合的探针，其5-3外切酶活性（此活性是

41、双链特异性的，游离的单链探针不受影响）就会将切割探针释放5端报告基团游离于反应体系中，远离3端荧光淬灭基团的屏蔽，5端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数PCRPCR扩增过程中：扩增过程中：Probes : Taqman (double dye) Probes : Taqman (double dye) 化学试剂化学试剂工作原理工作原理淬灭剂淬灭剂信号检测信号检测主要应用范围主要应用范围SYBR green I结合于双结合于双链链DNA的的小沟中小沟中无

42、无延伸延伸定量和检测目标基因定量和检测目标基因融解曲线分析融解曲线分析Molecular beacons发夹型杂发夹型杂交探针交探针有有复性复性SNP分析分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因Taqman水解型杂水解型杂交探针交探针有有任何步骤任何步骤SNP分析分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因三种不同探针的比较三种不同探针的比较数字PCR是一种绝对定量的工具当前DNA定量有三种， 光度法：基于DNA分子的吸光度来定量； 实时荧光定量：基于Ct值，也就是可以检测到荧光值对应的循 环数定量； 数字PCR：最新的定量技术，基于单分子PCR方法来采用计数 的方法对DNA进行定量II. II.

43、 数字数字PCR 主要采用当前分析化学热门研究领域-微流控的方法，将大量的稀释后的DNA溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的DNA模板数少于或者等于1个。 这样经过PCR循环之后，有一个DNA模板的反应器就会亮，没有DNA模板的反应器就是暗的。 根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的DNA浓度原理原理数字数字PCR原理原理 目的：目的：扩增产生特异长度的单链DNA 方法：方法：采用不等量的一对引物，若干循环后，量少的一种先 消耗完，剩下另一引物参与以后的循环反应，产生大 量单链DNA。两种引物的最佳比例一般是0.01： 0.5M(50-100:1)，关键是限制性引物的绝对量 用

44、途：用途：制备核酸序列测定的模板和杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 III. III. 不对称不对称PCR不同方式的PCR技术名称主要用途简并引物扩增法扩增未知基因片断巢式PCR提高pcr敏感性、特异性，分析突变多重PCR同时检测多个突变或病原反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变单一特异引物PCR扩增未知基因组DNA单侧引物PCR通过已知序列扩增未知cDNA原位PCR研究基因表达锚定PCR分析具备不同末端的序列冷却粘合冷却粘合冷却冷却连接酶链反应 高浓度引物高浓度引物低浓度引物低浓度引物是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。用

45、限制酶消化基因组DNA，用连接酶将各片段连接成环状。用限制酶切割已知序列，根据已知序列设计3端引物和5 端引物，扩增未知序列未知序列未知序列未知序列未知序列III.反向反向PCR (reverse PCR) 已知序列已知序列已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶用于检测特定基因序列的存在或缺失。用于检测特定基因序列的存在或缺失。电电泳泳引物引物IV.多重多重PCR 利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记，用以直观地检测目的基因 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 4V

46、. V. LP-PCR （Labelled primers)PCR观察观察PCR产物产物已知靶基因片段一侧的序列。已知靶基因片段一侧的序列。 以以mRNA为模板经为模板经RT合成合成cDNA，末端转移酶在，末端转移酶在cDNA3末端加上末端加上poly(dG)尾。尾。Poly(dC)锚定引物与锚定引物与poly(dG)尾互尾互补结合引导合成未知补结合引导合成未知DNA序列序列VI. VI. 锚式锚式PCRcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGGCCCC 锚定引物锚定引物3GGGGCCCC3GGGGCCCC生物素生物素化引物化引物检测检测探针探针信号信号VII. VII. PCR固相分析法

47、固相分析法 1990年，Haase等首创 利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物 可直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增 可进行细胞内定位 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列VIII. VIII. 原位原位PCR原位聚合酶链式反应（In Situ PCR）操作步骤：操作步骤： 1. 细胞或组织的固定 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物人类染色体端粒人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片 逆转录酶逆转录酶DNA聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂化双

48、链杂化双链PCR扩增扩增 逆转录PCR是用来扩增RNA的cDNA拷贝的方法。 RT-PCR非常灵敏，被用于从小量的mRNA生成大量的cDNA文库等领域； RT-PCR也能用于鉴定转录序列的突变及多态性IX. IX. 逆转录逆转录PCR（RT-PCR） 以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增 主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等。 逆转录生成cDNA方式： 以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为引物 以oligo(dT)为引物， mRNA3末端polyA与之互补 以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物热启动主要是通过抑制PCR反应体系一种基本成分，

49、延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。避免了起始循环较低温度下的非特异性扩增，提高了PCR反应的灵敏度及特异性 11. Hotstart PCR（热启动（热启动PCR） 通过在PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。 循环设在比估算的Tm 高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1到2，直到退火温度低于Tm约 5 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势 1 12 2. . Touchdown PCRTouchdown PCR（降落（降落PCRPCR） 判断判断PCRPCR反应的有效性和正确性：反应的有效性和正确性： 对PCR产物进行电泳，观察扩

50、增条带的有无扩增及扩增片段的大小 对产物进行定量分析和序列分析：对产物进行定量分析和序列分析： 检测产物中的点突变：PCR-RFLP PCR-ASO PCR-SSCP PCR-DGGE 融点曲线分析 PCR产物测序 PCRPCR产物检测产物检测凝胶电泳分析技术凝胶电泳分析技术 主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。其中琼脂糖凝胶电泳因操作简单，较常用，一般采用浓度为1-2%的琼脂糖凝胶 通过电泳分析技术可直接观察到有无扩增产物，及产物片段的大小，可用于扩增产物的定性分析HCMV PCRHCMV PCR产物电泳分析结果产物电泳分析结果594bp600bp2652bp800bp50bp350