第3节薄层色谱分离检测技术一课件.ppt

1、第第3节节 薄层色谱分离检测技术薄层色谱分离检测技术 一、分离原理一、分离原理 薄层色谱是一种开放性色谱，是将混合组分样品溶液点在薄层板一端的薄层色谱是一种开放性色谱，是将混合组分样品溶液点在薄层板一端的起始线上，点样处称为原点，在密闭容器中用适宜的流动相（薄层色谱法起始线上，点样处称为原点，在密闭容器中用适宜的流动相（薄层色谱法中又称为展开剂）展开。因吸附剂对不同组分的吸附能力不同，展开剂对中又称为展开剂）展开。因吸附剂对不同组分的吸附能力不同，展开剂对不同组分的解吸能力也不完全相同，造成各组分在薄层析上移动的速度有不同组分的解吸能力也不完全相同，造成各组分在薄层析上移动的速度有快有慢，经过

2、一段时间展开后，不同的组分彼此分开，最终形成相互分离快有慢，经过一段时间展开后，不同的组分彼此分开，最终形成相互分离的斑点的斑点 薄层色谱法薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC) 将固定相均匀平铺在光洁表面的玻璃、塑料或金属板上将固定相均匀平铺在光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法 可分为可分为吸附吸附、分配、分子排阻色谱法等、分配、分子排阻色谱法等 二、薄层色谱参数二、薄层色谱参数1比移值比移值(1(1）定义）定义 组分迁移的距离与展组分迁移的距离与展开剂迁移的距离之比开剂迁移的距离之比(

3、2)计算方法计算方法原点到溶剂前沿的距离原点到斑点中心的距离fR0llRAAf）（0llRBBf）（2相对比移值相对比移值sisisfifrllllllRRR00)()(/(1(1）定义）定义 指被测组分的比移值与参照组分的比移值之比指被测组分的比移值与参照组分的比移值之比 (2(2）计算方法）计算方法(3(3）特点）特点消除系统误差，消除系统误差， 值的重复性和可靠性都比值的重复性和可靠性都比 好好 rRfR3分离度分离度（1)1)定义定义衡量薄层色谱分离效果的重要指标，是衡量薄层色谱分离效果的重要指标，是指相邻两斑点中心至原点的距离之差与指相邻两斑点中心至原点的距离之差与两斑点平均径向宽度

4、（两斑点平均径向宽度（径向宽度是指斑径向宽度是指斑点沿着展开方向的宽度点沿着展开方向的宽度）的比值）的比值 (2(2）计算方法）计算方法21122112)( 22/ )(WWllWWllR三、仪器与材料三、仪器与材料1吸附剂吸附剂粒径粒径 540 m硅胶硅胶聚酰胺聚酰胺 微晶纤维素微晶纤维素 氧化铝氧化铝硅藻土硅藻土常用常用硅胶硅胶H硅胶硅胶G硅胶硅胶GF254硅胶硅胶HF254 想一想想一想 H、G、F各代表何种意思？试解释硅胶各代表何种意思？试解释硅胶HF365？2载板载板玻璃板玻璃板塑料膜塑料膜金属箔金属箔厚度厚度 2mm 规格规格5cm20cm10cm10cm10cm15cm10cm2

5、0cm 种类种类要求要求 表面光滑、平整清洁表面光滑、平整清洁 玻板处理措施玻板处理措施清洁剂或铬酸洗液浸泡洗涤，用清水充分清洗，再用清洁剂或铬酸洗液浸泡洗涤，用清水充分清洗，再用蒸馏水或去离子水冲洗，表面应不附水珠，晾干备用蒸馏水或去离子水冲洗，表面应不附水珠，晾干备用 3点样器点样器 手动手动全自动点样仪全自动点样仪定量毛细管 平口微量注射器平口微量注射器 3展开容器展开容器 平底色谱专用展开缸平底色谱专用展开缸双槽薄层色谱专用展开缸双槽薄层色谱专用展开缸 4显色剂显色剂显色剂适用范围显色方法斑点颜色浓硫酸乙醇溶液多数有机化合物喷雾加热多数加热后呈黑色碘多数有机化合物薰蒸多数显黄棕色磷钼酸

6、乙醇溶液醛等还原性物质喷雾烘干蓝色茚三酮试液氨基酸类喷雾或浸渍紫色或黄色三氯化铁-铁氰化钾试液含酚羟基化合物喷雾或浸渍红褐色或棕红色5显色装置显色装置 喷雾瓶喷雾瓶浸渍槽浸渍槽蒸气熏蒸蒸气熏蒸 -双槽展开缸双槽展开缸 6检视装置检视装置 紫外分析仪紫外分析仪(三用三用)摄像设备摄像设备薄层色谱扫描仪薄层色谱扫描仪(CS9301型）型）四、操作技术四、操作技术1薄层薄层板制备板制备自制薄自制薄层板层板 市售薄市售薄层板层板 无黏合剂无黏合剂分类分类含黏合剂含黏合剂10%15%煅石膏煅石膏 0.2%0.5%羧甲基纤羧甲基纤维素钠水溶液维素钠水溶液 操作方法操作方法普通薄层板普通薄层板(玻璃、聚酰胺

7、薄膜和铝基玻璃、聚酰胺薄膜和铝基)高效薄层板（高效薄层板（固定相粒径为固定相粒径为57 ） um分类分类操作方法操作方法临用前一般应在临用前一般应在110活化活化30分钟。聚酰胺薄膜不需分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板和聚酰胺薄膜可根据需要剪裁活化。铝基片薄层板和聚酰胺薄膜可根据需要剪裁 操作方法操作方法v 将将1 1份固定相和份固定相和3 3份水（或羧甲基纤维素钠水溶液）在研钵份水（或羧甲基纤维素钠水溶液）在研钵中沿同一方向研磨混匀，去除表面的气泡后，置玻璃板上中沿同一方向研磨混匀，去除表面的气泡后，置玻璃板上使涂布均匀，或倒入涂布器（见图使涂布均匀，或倒入涂布器（见图8-148-14

8、）中，在玻板上平）中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布稳地移动涂布器进行涂布( (涂层厚度为涂层厚度为0.2mm0.2mm0.3 mm)0.3 mm)，取涂好的薄层板，置水平台上于室温下晾干后，在取涂好的薄层板，置水平台上于室温下晾干后，在110110活化活化3030分钟，立即置于有干燥剂的干燥器中备用分钟，立即置于有干燥剂的干燥器中备用 。手动涂布器手动涂布器 2点样点样 普通板普通板点样基线点样基线-距底边距底边2.0cm 圆点状圆点状-R3mm条带状条带状-宽度宽度510mm 点或条带间距点或条带间距-8mm 点样量点样量- 10ul高效板高效板点样基线点样基线-距底边距底边0.81cm

9、 圆点状圆点状-R2mm条带状条带状-宽度宽度48mm 点或条带间距点或条带间距-5mm 点样量点样量- 5ul3. 展开展开 （1）展开要求）展开要求 查阅查阅 A.何为边缘效应何为边缘效应?何因？如何防止何因？如何防止? B.展开剂加入量展开剂加入量?展开剂展开距离？展开剂展开距离？（2）展开方式）展开方式 上行上行近水平近水平双向双向多次多次上行展开上行展开近水平展开近水平展开4检视检视有色物质斑点有色物质斑点-目光检视目光检视无色物质斑点无色物质斑点荧光检出法荧光检出法 化学检出法化学检出法 五、检测技术五、检测技术1系统适用性试验系统适用性试验检测灵敏度检测灵敏度 比移值比移值 分离

10、效能分离效能 2鉴别鉴别等浓度对照法等浓度对照法-同板同板-大致同位、同大、同色泽大致同位、同大、同色泽等体积混合法等体积混合法-斑点单一、紧密斑点单一、紧密 结构相似对比法结构相似对比法-Rf不同或两斑点不同或两斑点3杂质检查杂质检查 杂质对照品法杂质对照品法 样品溶液的自身稀释对照法样品溶液的自身稀释对照法 二者合用法二者合用法4定量方法定量方法（1）目视比色法）目视比色法 -半定量法（精度半定量法（精度10%）（2）斑点洗脱法）斑点洗脱法 （3）薄层扫描法）薄层扫描法(正在减小使用正在减小使用) 第第4节节 纸色谱分离技术纸色谱分离技术 一、分离原理一、分离原理(液液-液萃取液萃取 )

11、利用样品中不同组分在两相溶剂中溶解性（或分配系数）不利用样品中不同组分在两相溶剂中溶解性（或分配系数）不同，当流动相携带样品流经固定相（被吸附或固定在惰性材料同，当流动相携带样品流经固定相（被吸附或固定在惰性材料上的液体）时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取、再溶解、上的液体）时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取、再溶解、再萃取，再萃取，样品经过多次反复分配后，造成分配系数稍有，样品经过多次反复分配后，造成分配系数稍有差异的组分移行的距离不同面实现分离差异的组分移行的距离不同面实现分离 .二、仪器与材料二、仪器与材料 1色谱滤纸色谱滤纸想一想想一想:色谱滤纸如何选择色谱滤纸如何选择?2展开剂展

12、开剂（1）纸色谱一般固定相是什么）纸色谱一般固定相是什么?（2）纸色谱展开剂如何选择）纸色谱展开剂如何选择?3展开容器展开容器 圆形或长方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃盖且能密闭圆形或长方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃盖且能密闭 下行纸色谱展开缸下行纸色谱展开缸三、操作技术三、操作技术1色谱滤纸的准备色谱滤纸的准备（1）用于下行法的色谱滤纸）用于下行法的色谱滤纸 （2）用于上行法的色谱滤纸）用于上行法的色谱滤纸 2点样点样 样品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量样品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量毛细管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分毛细管或微量注射器吸取溶液，点于

13、点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，俟其自然干燥、低温烘干或经温热气次点加，每次点加后，俟其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干，点样流吹干，点样直径为直径为2 mm4mm，点样量取决于色谱滤纸，点样量取决于色谱滤纸的薄厚程度和显色剂的灵敏度，一般几到几十微克。的薄厚程度和显色剂的灵敏度，一般几到几十微克。点间距点间距离约为离约为1.5cm2.0cm，样点通常为圆形，也可点成条形。，样点通常为圆形，也可点成条形。 3展开展开纸色谱下行展开纸色谱下行展开纸色谱上行展开纸色谱上行展开4斑点定位斑点定位v 纸色谱法斑点的定位基本和薄层色谱法相似，但纸色谱法不能使用纸色谱法斑点的定位基本和薄层色谱法

14、相似，但纸色谱法不能使用腐蚀性显色剂，也不能在高温下显色。腐蚀性显色剂，也不能在高温下显色。v 运用纸色谱进行药物的鉴别、检查和含量测定的方法、要求与薄层运用纸色谱进行药物的鉴别、检查和含量测定的方法、要求与薄层色谱法一致色谱法一致 第第5节节 应用案例应用案例一、柱色谱法的应用案例一、柱色谱法的应用案例 案例案例8-1 黄芪含量测定中样品溶液的制备黄芪含量测定中样品溶液的制备1黄芪中主要活性成分是什么黄芪中主要活性成分是什么?如何提取和纯化如何提取和纯化?2.提取液用氨试液洗涤的目的是什么提取液用氨试液洗涤的目的是什么?3.D101水洗和水洗和40%乙醇液洗脱液为何弃去乙醇液洗脱液为何弃去?

15、 二、薄层色谱法应用案例二、薄层色谱法应用案例案例案例8-2 六味地黄丸中牡丹皮的鉴别六味地黄丸中牡丹皮的鉴别1.牡丹皮牡丹皮 的鉴别指标是什么的鉴别指标是什么?鉴别原理是什么鉴别原理是什么?2.为何选择环己烷为何选择环己烷-乙酸乙酯（乙酸乙酯（3:1）为展开剂）为展开剂 ?显色方式是什么显色方式是什么?3鉴别结果鉴别结果 六味地黄丸薄层色谱图（六味地黄丸薄层色谱图（1.丹皮酚；丹皮酚；25.六味地黄丸六味地黄丸） 案例案例8-3 甲苯咪唑中有关物质检查甲苯咪唑中有关物质检查 1.TLC法检查杂质常用有哪些方法法检查杂质常用有哪些方法?2.检查中为何采用硅胶检查中为何采用硅胶GF254?3.甲苯咪唑中有关物质的限度是多少？甲苯咪唑中有关物质的限度是多少？