细胞破碎蛋白质复性和固液分离-生物探索课件.ppt

1、第五章 细胞破碎、蛋白质复性和固液分离广州大学生命科学学院 柯德森 产物提纯过程的不同决定于：对象材料、目标产物特性及对其纯度的要求； 包括两个基本阶段：初级分离阶段、纯化精制阶段。细胞破碎固液分离初级分离(粗)纯化精制 下游技术基本过程 初级分离：分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包含体（包涵体），复原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等过程。主要决定产物的得率。 纯化精制：在初级分离的基础上，用各种高选择性手段，主要是各种层析技术，将目标产物和干扰杂质尽可能地分开，使产物的纯度达到有关要求。主要决定产物的纯度。总原则：控制时间、温度、pH值，减少与空气接触的机会，设计好各组分的分离顺序

2、第二节 细胞破碎 目的：释放细胞内含物。 分类：按照是否存在外加作用力分为机械法和非机械法。 问题： 破碎率是否越高越好？ 高压匀浆比珠磨法破碎细胞的效果好？破碎方式机械法非机械法固体剪切作用液体剪切作用干燥处理溶胞作用珠磨法高压匀浆压榨超声破碎酶溶法化学法物理法细胞破碎方法分类图1、高压匀浆法 组成：高压泵和匀浆阀； 作用机理：高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的。意大利Niro-Soavi实验室级高压均质机高压匀浆阀结构示意图进液口

3、出液口阀座碰撞环阀杆高压匀浆法动力学方程 破碎效率与匀浆阀结构、操作压力和破碎次数有关： Ln(Rm/(Rm-R)=KNPaR：单位生物量释放出的产物量（mg/G)Rm是R的最大值；K：破碎速率常数；N：破碎次数；P：操作压力；a:与微生物性质有关的指数系数。温控和能耗 破碎率-操作压力-温度控制-能耗温度对活性物质的失活作用；能耗与操作压力有关：3.5KW/100MPa能耗也用于温控： 23.8C/100MPa存在问题 堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地坚硬如包含体易损伤匀浆阀也不适合 温度高易失活，能耗大。2、高速珠磨法 原理：细胞和极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间及珠子与细

4、胞之间互相剪切，碰撞，促使细胞壁破裂，释放内含物。几种常见珠磨器常见珠磨器举例（广东正本）动力学方程 间歇操作:Ln(Rm/(Rm-R)=Ln(D)=Kt D=(1+K1/J)J 连续操作Ln(Rm/(Rm-R)=KV/f=K温控和能耗 采用夹套冷却的方式实现温控,效果较好; 能耗与细胞破碎率成正比; 问题： 破碎率是否越高越好？ 高压匀浆比珠磨法破碎细胞的效果好？3、超声破碎 机理：声频高于1520kHz的超声波在高强度声能输入时可以进行细胞破碎，破碎机理尚未清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。 破碎效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。 优点：操作简便液量损失

5、少 存在问题：使敏感物质变性失活，噪声大，大容量时效率低，应用潜力有限。 空化现象：在强声波作用下，引起气泡形成，胀大和破碎的现象。超声波破碎仪大功率超声波破碎仪4、化学渗透法 作用机理：某些有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫渗透法。 问题：EDTA、甲苯、Triton X-100、盐酸胍和脲的作用机理？ 优点（相对机械破碎）： 对产物释出有一定的选择性； 细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取； 核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。 缺陷： 时间长，效率低； 化学试剂有毒； 通用性差5、酶溶法

6、机理：就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。 常用的溶酶：溶菌酶(lysozyme)、B-1,3-葡聚糖酶(glucanase)、B-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶（protease)、甘露糖酶(mannanase)、肽链内切酶（endopeptidase)、壳多糖酶(chitinase)、细胞壁溶解酶（几种酶的复合物）等 优点： 一定的选择性； 细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一步分离过程 缺点：（只能用于实验室） 产物抑制造成效率低下； 溶酶价格高； 通用性差， 不易确定最佳条件；6、微波加热法 机理：微波加热导致细胞内极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量热量，使胞内温度迅速上升

7、，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成微小孔洞，进一步加热可导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。 优点：微波穿透性强，选择性高、加热效率高。 缺陷： 一般只适合对热稳定物质的分离； 被处理的物料要具有良好的吸水性； 不适于富含淀粉和树胶等的天然植物第三节 蛋白质复性 包含体（包涵体，inclusion bodies):存在于基因工程细胞中，主要由蛋白质构成，其中大部分是克隆表达的产物，这些产物在一级结构上是正确的，但在立体结构上却是错误的，因此没有生物学活性。难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。 包含体形成原因：（比较复杂，目前尚不完全清楚。） 缺少某些协助因子（

8、分子伴侣？）或者由于周围物理环境（温度等）不适，使其难以连续进行次级键的形成，中间产物相互凝集而积累形成包含体。问题：是否应该设法减少包含体的形成？如何减少？ 减少包涵体形成的策略减少包涵体形成的策略1、 降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成4。2、 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加

9、剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl5。3、 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。 蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。包含体的分离及溶解包含体的分离及溶解 分离包含体：第一步是对培养收集的细胞进行破碎，比较有效的方法是高压匀浆结合溶菌酶处理，然后500020000g离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离

10、洗涤：包涵体沉淀需用去污剂（Triton X-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤除去脂类和膜蛋白，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解溶解：包涵体的溶解必须用很强的变性剂，如8mol/L尿素、68mol/L盐酸胍，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，异氰盐酸胍最强；去污剂，如SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸，如70%甲酸，可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂

11、（如DTT、GSH、-ME）打开蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应10。要求了解：用于溶解包含体的主要（1）增溶剂（变性剂、去污剂、酸）及其增溶机理；（2）主要还原剂，为什么加入还原剂；（3）主要金属螯合剂，为什么要加入。蛋白质的折叠机理蛋白质的折叠机理 包涵体蛋白在变性剂作用下，为可溶性伸展态，在变性剂去除或浓度降低时，就会自发的从变性的热不稳状态向热力学稳定状态转变，形成具有生物活性的天然结构。蛋白质的折

12、叠机制，目前有多种不同的假设，但很多学者认为有一个“熔球态”的中间状态，在“熔球态”中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构，蛋白质的具体步骤可用下式描述： 伸展态中间体后期中间体天然态体聚集体提高重组蛋白质折叠复性的方法提高重组蛋白质折叠复性的方法 错误发生的原因：在去除变性剂的同时，重组蛋白质在体外折叠，分子间存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低，包涵体蛋白折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争。 错误发生的机制： 在折叠反应中，从伸展态到中间体的速度是非常快的，只需要几毫秒，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢

13、，是一个限速过程。聚集过程与复性过程相互竞争，故而应尽量避免聚集体的产生。 错误发生的机制一般认为，蛋白质在复性过程中涉及两种疏水作用，一是分子内的疏水相互作用，可促进蛋白质正确折叠；一是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用，在复性过程中，部分折叠的中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸的顺序决定，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。 不同条件下具体复性方式 1、透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，原理都是使变性剂浓度降低到蛋白质能恢复

14、折叠的浓度。 缺点：复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的分离纯化；透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大 问题：包含体蛋白质含 有二个以上二硫键应该如何处理？为什么要在复性完成后再加入氧化剂？2、高蛋白浓度下的复性方法：（一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。） 一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中。在两次蛋白加入之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过了易聚集的中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。第二种方法是用温

15、度跳跃策略：变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。 3、 添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。 通常使用的促进剂有： a、共溶剂、共溶剂：如PEG600020000，通过与中间体特异的形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少

16、蛋白质的聚集； b、去污剂及表面活性剂：、去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除； c、氧化、氧化-还原剂：还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率； d、小分子的添加剂：、小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集，它们的作用可能为：稳定蛋白的活性状态、降低非正确折叠的稳定性、增加折叠中间体的稳定性、增加解折叠状态

17、的稳定性。 e、0.40.6M L-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。 通常使用的促进剂有： f、添加分子伴侣和折叠酶：添加分子伴侣和折叠酶：分子伴侣是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象，并能通过有控制的结合和释放，促进新生多肽链的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输的一类蛋白质。折叠酶有二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等。分子伴侣和折叠酶都能在体外调节蛋白质的正确折叠，提高蛋白质的合成效率。但这类蛋白在折叠复性后要除去，而且十分昂贵，因此采用可回收利用的方法如固定化法为好。

18、g、人工伴侣、人工伴侣：为模仿分子伴侣而发展的一种方法：首先，变性蛋白被复性液中的去污剂捕获，形成蛋白-去污剂复合体，复合体的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入环糊精从复合体中去除去污剂，使得蛋白质正确折叠。 h、单克隆抗体、单克隆抗体：待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助复性，但只限于此蛋白才能获得明显的助折叠作用。 I其它：其它：多聚离子化合物如肝素可以促进蛋白质的复性，具有稳定天然蛋白质的作用；甘油可以增加黏度，减少分子碰撞的机会，减少错配以提高复性效率；适量的盐浓度可以降低某些带电基团间的斥力，有利于蛋白质的折叠；辅助因子、短链醇、高渗物等能有效的降低聚集体的形成，对蛋白有稳定的作用。 4、

19、 液相色谱（LC）复性法：疏水相互作用色谱（HIC）、离子交换色谱（IEC）、凝胶排阻色谱（SEC）、亲和色谱（AFC）已成功的对变性蛋白进行了复性。 4种色谱法，SEC的分离效果是LC中最差的，盐酸胍会在IEC柱上保留，与蛋白一起洗脱下来，AFC使用范围窄、所需时间长、价格昂贵，HIC是其中较为理想的。 变性蛋白在HIC上的复性机理为：当蛋白质、变性剂和杂蛋白进入HIC系统后，由于变性剂在柱子上的作用力较弱，变性蛋白质的作用力较强，变性剂首先同变性的蛋白质分离，随流动相一起流出色谱柱，又因HIC固定相能提供较常法高出十至数百倍的能量*，在变性蛋白质被HIC固定相吸附的同时瞬时除去以水合状态附

20、着在蛋白质表面和与固定相表面接触区域的小分子*，而蛋白质的特定的疏水性氨基酸残基与HIC固定相表面作用以形成区域立体结构，接着形成折叠中间体，随着流动相的不断变化，变性蛋白质不断地在固定相表面上进行吸附-解吸附-再吸附，并在此过程中逐渐被复性，形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质，并流出色谱柱。HIC固定相是从高盐溶液中吸附变性蛋白质，且与变性剂瞬时分离，不仅大大降低了蛋白质间的聚集作用，还因固定相在分子水平上为变性蛋白提供里很高的能量，使水化的变性蛋白质瞬时失水，并形成局部结构以利于蛋白质从疏水核开始折叠。HIC在蛋白质复性的同时还能与其它杂蛋白进行很好的分离，且HIC柱便宜、快速，故有很好的发

21、展潜力。与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是： 在进样后可很快的除去变性剂； 色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率； 在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行； 便于回收变性剂，降低废水处理成本。5、反胶束复性法：由于蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性，运用相转移技术可以将蛋白质分子包于反胶束内，由于这样可使蛋白质相互分离，减少了蛋白质折叠过程中的聚集作用，通过逐渐降低变性剂的浓度和加入氧化-还原剂，可使变性蛋白质复性

22、，但表面活性剂对蛋白质具有变性作用。 第四节 固液分离 分离细胞、细胞碎片、包含体、沉淀物等的手段，不仅应用于初级阶段，而且也应用于精制阶段。一、离心沉降 根据固体和液体之间的密度差,利用离心机提供的离心力实现固液分离的手段. 是实现固液分离的主要手段; 优点：技术易掌握；结果重复性好 沉降的难易取决于固体物质和液体的密度差,同时还取决于固体和液体的其他性质以及离心机的离心能力.(可以颗粒沉降速度表示) 斯托克斯公式(Stokes): Uc=d2(s-L)r2/18 Uc 颗粒沉降速度; d颗粒直径(假定为球形) s是固体密度 L是液体密度 r离心半径; 角速度; (r2:离心力) 粘度 (r

23、2:离心力):是固液分离最重要的影响因素; 分离因数: a= (r2:离心力)/g a是衡量离心力的大小主要指标,应该主要是增大角速度而不是直径; 提高离心效果可通过增加转速和延长时间来取得；转筒常规工业用离心机（-张家港华大离心机公司） SSC型离心机为三足式上部人工卸料沉降离心机，该系列离心机装鼓壁上无孔，属沉降型转鼓，操作维修方便。主要使用于固相颗粒细小，悬浮液粘性较大，过滤介质再生困难，且含量较少的悬浮液的固液分离。 管式工业用离心机（-张家港华大离心机公司） 悬浮液从进料管进入转鼓，固相颗粒在离心力场作用下受到离心力的加速沉降至转鼓内壁，沉降的颗粒在螺旋输送器叶片的推动下，从（直筒段

24、）沉降区通过（锥段）干燥区至固相出口排出；经澄清的液相从溢流孔溢出。从而实现固、液相自动、连续的分离。 可应用于脱水、浓缩、分级澄清等不同场合。刮刀卸料工业用离心机（-张家港华大离心机公司）主电机带动套装的内外转鼓全速旋转，物料由进料管引入转鼓，在离心力作用下，液相物穿过滤布和内转鼓壁滤孔排出内转鼓，汇集到内外转鼓间的间隙内，穿过到虹吸室的通孔进入虹吸室，再由虹吸装置抽走排出机外。固相物截留在内转鼓形成环形滤饼层。进料达到预定容积后停止进料，进一步分离，此时可进行洗涤。洗涤、分离结束，刮刀自动旋转，将固相物刮下经输料螺旋排出机外，然后自动洗网，开始下一个循环。二、微孔膜过滤根据流体各组分尺寸大

25、小的不同，利用高分子聚合膜，过滤分离微米级的细胞、细胞碎片和生物大分子的过程，叫微孔膜过滤。目前主要有三种膜过滤方式： 微孔过滤： 超滤： 反渗透：切割分子量? 微孔膜 超滤膜 反渗透膜优点： 容易做到封闭式操作，不受环境污染 设备投资少，操作安全； 加工量可大可小，十分方便； 有利于分离密度差小而难以离心的固体，可直接用于下游的层析过程。缺点： 技术难以掌握，影响因素多； 稳定性和重复性不好； 膜堵塞问题是最难以解决的问题微滤技术要点：1. 选择合适的膜：不与蛋白质、脂类等发生吸附；选择合适的孔径；无机陶瓷膜的选择及其优点2. 选择合适的操作条件： 达西公式： V=P/(Rc+Rm) 问题：

26、从达西公式分析操作条件的选择，维持Rc(滤饼阻力)方式？无机陶瓷膜的优缺点 优点：（机械强度大、惰性更大） 孔径均匀，过滤效果好； 耐蒸气消毒、耐酸碱和有机溶剂； 坚固耐用，使用寿命长； 可以加压反向冲洗 缺点： 造价高； 过滤面积小； 表现对蛋白质一定的吸附；各种微孔膜柱及设备各种微孔膜柱及设备操作方式1. 切向流过滤（错流过滤、交叉流过滤、十字过滤）：就是一种维持恒压下高过滤速度的技术，其原理就是：使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用液体的剪切作用将介质表面的固体移走，当移走固体与固体沉积速率相同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的过滤速度。（实际是维持了c).目

27、前几乎所有的膜固液分离都采用切向流方式切向流过滤的缺点 产生的剪切力使蛋白质产物失活，流速越快，失活越严重； 能耗比较高； 不能避免膜的污染和堵塞，当膜的阻力增大时，无法防止过滤速度的下降；、脉冲反洗切向流过滤 原理：在切向流过滤中间歇地在膜的背面加一反压，迫使部分滤液反透过膜以冲掉膜上的固体沉积和膜孔中的堵塞物，使过滤速度保持在比较高的水平。、调整生化悬浮液的性质 调整pH值和离子强度； 加入絮凝剂； 加入过滤助剂（硅藻土系列）三、双水相萃取 原理：利用被提取物在二相中的分配不同而实现分离的目的；由于蛋白质在有机相中容易失活，因此采用的二相均为亲水相，如PEG/葡聚糖、无机盐等，称为双水相，

28、两相密度不同，轻相富含一种高分子，重相可能富含另一高分子，细胞碎片和蛋白质在二相间的分配系数不同，从而实现分离的目的。 清除细胞碎片比一般离心和过滤法优越。PEG?(聚乙二醇)双水相萃取的一般考虑 一般的原则是将碎片分配在下层(调节和无机盐浓度比例，可以控制细胞碎片在上下层间的分配)其好处有： 核酸等大部分杂质一般处于下相，可以一并除去； 下相是无机盐富集相，作为废弃物成本低些； 蛋白质保持于上相的层有利于其活性的保持； 碎片在下相有利于离心机的连续分离；双水相萃取的一般考虑 最困难的是如何使需要的蛋白质尽量集中在上相因此要考虑的问题是: 浓度； 分子量； 盐和pH值四、泡沫分离法 原理：基于

29、溶液中溶质（或颗粒）间表面活性的差异进行分离的一种方法，表面活性强的物质优先吸附于分散相（气相）与连续相（液相）的界面处，被气泡带出连续相而达到浓缩。影响泡沫分离的主要因素 表面活性剂的浓度； 气速； pH值； 离子强度； 泡沫层高度避开固液分离的探索-扩张床吸附流化床流化床?问题 举例说明机械法和非机械法破碎细胞的分类,基本原理及优缺点. 试述包含体复性的基本过程,复性过程错误发生的主要原因是什么?举例分析主要的复性方法的优缺点,为什么LC复性是最好的? 包含体蛋白质含 有二个以上二硫键应该如何处理？为什么要在复性完成后再加入氧化剂？问题 写 出斯托克斯公式,分析其基本意义.从该公式分析离心的主要条件. 从达西公式分析利用膜进行固液分离要注意的问题,其目前存在的主要困难是什么? 双水相萃取的概念?为什么要进行双水相萃取?双水相萃取的主要操作原则是什么?如何做到?