Hb的醋酸纤维薄膜电泳与血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳课件.ppt

1、v1. 1. 掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作v2. 2. 了解血红蛋白的组成及分类了解血红蛋白的组成及分类v 蛋白质离子在电场的作用下，可向着与其蛋白质离子在电场的作用下，可向着与其电性相反的电极移动。由于各种蛋白质电性相反的电极移动。由于各种蛋白质pI不同，不同，在同一在同一pH环境中所带电荷量也不同，同时分环境中所带电荷量也不同，同时分子大小形状各有差异，所以在同一电场中泳动子大小形状各有差异，所以在同一电场中泳动速度不同。一般来说，所带的电荷多而颗粒小速度不同。一般来说，所带的电荷多而颗粒小者，泳动速度快，反之则慢。据此，可用电泳者，泳动速度快，反之则慢。据此，可用

2、电泳法将血清中的各种蛋白质加以分离。法将血清中的各种蛋白质加以分离。v（一）试剂（一）试剂v0.9%的的NaCl溶液；溶液； 四氯化碳；四氯化碳； TEB缓冲缓冲液（液（pH8.6）；硼酸）；硼酸-氢氧化钠缓冲液氢氧化钠缓冲液（pH8.6）；丽春红染液；漂洗液。）；丽春红染液；漂洗液。v（二）实验器材（二）实验器材v醋酸纤维薄膜；培养皿；滤纸；镊子；玻醋酸纤维薄膜；培养皿；滤纸；镊子；玻璃板；电泳仪。璃板；电泳仪。v1.取血：用取血：用2%碘酒棉球消毒手指，再用碘酒棉球消毒手指，再用75%酒精棉球酒精棉球脱碘，采血针穿刺，取血约脱碘，采血针穿刺，取血约0.05ml放入放入1.5ml离心管中，离

3、心管中，并轻轻摇匀。并轻轻摇匀。v2.制备制备Hb液：液：v1）洗涤红细胞：加）洗涤红细胞：加0.9%NaCl 1ml于上述离心管中，于上述离心管中，颠倒混匀颠倒混匀5-6次，次，4000rpm，离心，离心3分钟。弃上清，再加分钟。弃上清，再加1ml 0.9%NaCl重悬，相同条件重复离心一次。重悬，相同条件重复离心一次。v2）溶血：向红细胞沉淀中加入蒸馏水）溶血：向红细胞沉淀中加入蒸馏水1滴，摇匀，再滴，摇匀，再加入四氯化碳加入四氯化碳1滴，振荡混匀，相同条件再离心一次，滴，振荡混匀，相同条件再离心一次，取上清即得取上清即得Hb液。液。v3. 电泳电泳v1）膜条准备：）膜条准备：v2）点样：

4、把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗）点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余液体，然后平铺在玻璃板上（滤纸内吸干多余液体，然后平铺在玻璃板上（毛毛面朝上面朝上），用小玻片沾取适量），用小玻片沾取适量Hb液，按印于点液，按印于点样线上，点样处离膜条边缘样线上，点样处离膜条边缘1.5cm左右。左右。v3）电泳：在电泳槽内加入缓冲液，膜条点）电泳：在电泳槽内加入缓冲液，膜条点样面向下，上样一端靠近负极，纱布条浸润样面向下，上样一端靠近负极，纱布条浸润膜条搭成滤纸条并盖严电泳室。通电先预电膜条搭成滤纸条并盖严电泳室。通电先预电泳泳5-10min。调节电压为。调节电压为150V，电泳时间约，电

5、泳时间约为为25 分钟。分钟。v4）染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染）染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中染色色液中染色10 分钟。分钟。v4. 漂洗：取出染色膜条并移至漂洗液中漂洗漂洗：取出染色膜条并移至漂洗液中漂洗至蛋白底色脱净，观察色带清晰的电泳图谱至蛋白底色脱净，观察色带清晰的电泳图谱并分析结果。并分析结果。v观察膜条上观察膜条上Hb条带的位置及颜色的深浅。条带的位置及颜色的深浅。v六、思考题：六、思考题：(Questions)v电泳分离蛋白质的原理是什么？电泳分离蛋白质的原理是什么？v 出现异常血红蛋白的临床意义是什么？出现异常血红蛋白的临床意义是什么？v一、实验目的（一、实验

6、目的（Experimental Objectives）：）：v1. 掌握血清脂蛋白测定的临床意义掌握血清脂蛋白测定的临床意义;v2.了解血清脂蛋白电泳的基本原理及操作方法。了解血清脂蛋白电泳的基本原理及操作方法。 v血清中的脂类物质以不同的比例与载脂蛋白结合成血清中的脂类物质以不同的比例与载脂蛋白结合成脂蛋白。在脂蛋白。在pH较大的缓冲液中，脂蛋白带负电荷，较大的缓冲液中，脂蛋白带负电荷，在电场中向正极泳动。各种脂蛋白因其所带的负电在电场中向正极泳动。各种脂蛋白因其所带的负电荷量及颗粒大小、形状等不同，在电场中的泳动速荷量及颗粒大小、形状等不同，在电场中的泳动速度也不一样，故可将其分离，用不同

7、方法显色便可度也不一样，故可将其分离，用不同方法显色便可进行定性、定量分析。进行定性、定量分析。v用琼脂糖凝胶作支持物进行电泳，先将血清用脂类用琼脂糖凝胶作支持物进行电泳，先将血清用脂类染料（苏丹黑染料（苏丹黑B或油红或油红O）预染，使脂蛋白着色，经）预染，使脂蛋白着色，经电泳后可将血清脂蛋白分成三条清晰的区带，可用电泳后可将血清脂蛋白分成三条清晰的区带，可用光密度计扫描定量，亦可将各脂蛋白区带切下，进光密度计扫描定量，亦可将各脂蛋白区带切下，进行比色定量。行比色定量。v（一）试剂（一）试剂v巴比妥缓冲液（巴比妥缓冲液（pH8.6 I=0.075）；制胶）；制胶缓冲液（缓冲液（pH8.6 I=

8、0.05）；）； 0.45%琼脂糖琼脂糖凝胶；苏丹黑凝胶；苏丹黑B染色液：制胶缓冲液染色液：制胶缓冲液（pH8.6 I=0.05）v（二）设备（二）设备 电泳仪和电泳槽；普通离心机；水浴箱；电泳仪和电泳槽；普通离心机；水浴箱；微量加样器、载玻片等微量加样器、载玻片等v1预染血清：取预染血清：取Eppendof 管一支，加入血清管一支，加入血清0.2ml及苏丹黑及苏丹黑B染料液染料液0.02ml，混匀后置于，混匀后置于37C水浴中预染水浴中预染30分钟，分钟，2000rpm离心离心5分钟，取上清分钟，取上清液备用。液备用。v2.制备琼脂糖胶板：将制备琼脂糖胶板：将0.45%的琼脂糖凝胶水浴煮的琼

9、脂糖凝胶水浴煮沸溶解后，用吸管吸取凝胶溶液均匀铺于载玻片沸溶解后，用吸管吸取凝胶溶液均匀铺于载玻片上，每片约上，每片约2.5ml，趁热将长为，趁热将长为15mm的硬纸片插的硬纸片插在与载玻片短边平行相近在与载玻片短边平行相近2cm处的凝胶中，静置处的凝胶中，静置约半小时后凝固。此时小心将纸片取出，凝胶板约半小时后凝固。此时小心将纸片取出，凝胶板上出现一小凹槽。上出现一小凹槽。v3.点样：用微量加样器吸取预染血清约点样：用微量加样器吸取预染血清约15l，注入上述凹槽内。，注入上述凹槽内。v4.电泳：将点样的凝胶板平行放于电泳槽电泳：将点样的凝胶板平行放于电泳槽中，点样端置于负极。用浸泡了电极缓冲

10、中，点样端置于负极。用浸泡了电极缓冲液的纱布搭桥，使凝胶板两端与电泳槽缓液的纱布搭桥，使凝胶板两端与电泳槽缓冲液相连。平衡冲液相连。平衡3-5分钟。接通电源，调电分钟。接通电源，调电压压100V，约，约45分钟，观察到分开的电泳条分钟，观察到分开的电泳条带后关闭电源，取出带后关闭电源，取出凝胶板观察结果。凝胶板观察结果。v肉眼观察各区带的颜色深浅宽窄及其排列顺序，肉眼观察各区带的颜色深浅宽窄及其排列顺序，绘图纪录之。绘图纪录之。v1.计算计算v2.临床意义：临床意义：v1.正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从正极到正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从正极到负极依次为负极依次为-脂蛋白、前脂蛋白、前-脂蛋白和脂蛋白和-脂蛋白，脂蛋白，原点处应无乳糜微粒。原点处应无乳糜微粒。v2.正常参考值：正常参考值：-脂蛋白脂蛋白=25.74.1%v 前前-脂蛋白脂蛋白=214.4%v -脂蛋白脂蛋白=53.35.3%CMv 电泳时点样端置于哪一极，为什么？电泳时点样端置于哪一极，为什么？v血浆脂蛋白的分类、组成以及生理功能。血浆脂蛋白的分类、组成以及生理功能。