(修改)实验四--Hb的醋酸纤维薄膜电泳与血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳课件.ppt

1、v电泳电泳：指带电胶体粒子或分子在电场的作：指带电胶体粒子或分子在电场的作用下，作定向移动。用下，作定向移动。v 由于各种物质分子的等电点不同、分由于各种物质分子的等电点不同、分子量、分子结构不同，形状大小各有差异子量、分子结构不同，形状大小各有差异，所以在同一，所以在同一P环境中所带的电荷量各环境中所带的电荷量各有不同，因此在同一电场中泳动速度也就有不同，因此在同一电场中泳动速度也就不同。一般来说，所带的电荷多而分子量不同。一般来说，所带的电荷多而分子量、形状小者，泳动速度快，反之则慢。、形状小者，泳动速度快，反之则慢。v 1）显微电泳显微电泳即在显微镜下观即在显微镜下观察胶体粒子或细胞的移

2、动度，也称细察胶体粒子或细胞的移动度，也称细胞电泳。胞电泳。 2）自由电泳自由电泳即悬浮在介质中即悬浮在介质中的细胞和生物大分子，在有电场作用的细胞和生物大分子，在有电场作用下自由定向移动。下自由定向移动。v 3）区域电泳区域电泳（区带电泳）：即（区带电泳）：即在不同电力条件、支持物上进行直接在不同电力条件、支持物上进行直接分离，鉴定生物物质，促使获得各自分离，鉴定生物物质，促使获得各自电荷差异的生物粒子或分子形成各自电荷差异的生物粒子或分子形成各自区域以帯形停留在载体上。如：滤纸区域以帯形停留在载体上。如：滤纸、淀粉、琼脂、纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉、琼脂、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等，此类凝胶等

3、，此类 电泳技术分离技巧简便电泳技术分离技巧简便，运用十分广泛。，运用十分广泛。 4）免疫电泳免疫电泳：即抗原与抗体在比：即抗原与抗体在比例合适的琼脂糖载体中相结合的一种例合适的琼脂糖载体中相结合的一种电免疫技术，亲和电泳即属此类。电免疫技术，亲和电泳即属此类。v1.1.连续系统连续系统：电泳：电泳缓冲缓冲液的离子成分、液的离子成分、PHPH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液相同、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液相同，带电颗粒电泳时仅具有，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应电荷效应、分子分子筛效应筛效应。 2 2. .不连续系统不连续系统：电泳：电泳缓冲缓冲液离子成分、液离子成分、pHpH、电位梯度与制

4、胶（或浸膜）缓冲液不尽、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液不尽相同，相同，带电颗粒电泳时具有带电颗粒电泳时具有浓缩效应浓缩效应、电电荷效应荷效应、分子筛效应分子筛效应。1.掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作 2. 了解血红蛋白的组成及分类了解血红蛋白的组成及分类v 血红蛋白（血红蛋白（Hb) 的组成及分类的组成及分类： 血红蛋白（血红蛋白（Hb)：由亚铁血红素、珠蛋白：由亚铁血红素、珠蛋白 组成组成 。每个珠蛋白分子由每个珠蛋白分子由4条多肽链构成条多肽链构成 ，根据其一级，根据其一级结构的不同可分为结构的不同可分为、四种类型。四种类型。 正常成人Hb种类： 组成 百分含量 pI

5、HbA 22 9598% 6.95HbA2 22 23% 7.38HbF 22 6.95 v在PH8.6的环境中，Hb是一种带负电荷的蛋白质（Hb的pI 8.6） ，因此，与醋酸纤维薄膜作支持物，在电场中Hb向阳极泳动。电泳时，由于各种Hb所带电荷的不同，造成各自的泳动速度不同，因而被分离。这种分离可初步鉴定不同的Hb。v醋酸纤维素薄膜是由纤维素的羧基进醋酸纤维素薄膜是由纤维素的羧基进行乙酰化后而制成的，浸湿后有巨大行乙酰化后而制成的，浸湿后有巨大的张力和柔韧性，几乎对所有生物活的张力和柔韧性，几乎对所有生物活性物质均能通过电泳作用得到分离。性物质均能通过电泳作用得到分离。v醋酸纤维素薄膜电泳

6、因设备简单、操醋酸纤维素薄膜电泳因设备简单、操作方便、电泳时间短、分辨率高、区作方便、电泳时间短、分辨率高、区带分离清晰、无拖尾、易定量等，已带分离清晰、无拖尾、易定量等，已成为临床、实验室首选的方法成为临床、实验室首选的方法。v1.取血取血：用碘伏及：用碘伏及75%酒精棉球消毒手指尖，酒精棉球消毒手指尖，采血针穿刺采血针穿刺,取血约取血约0.05ml放入放入1.5mlEP管管中，并轻轻摇匀。中，并轻轻摇匀。v2.制备制备Hb液液：v 1）洗涤红细胞：加）洗涤红细胞：加0.9%NaCl 1 ml于上于上述管中，颠倒混匀述管中，颠倒混匀5-6次，次，3000rpm/分，离分，离心心3分钟，弃上清

7、液。重复以上操作一次。分钟，弃上清液。重复以上操作一次。v 2）溶血：向红细胞沉淀中加入蒸馏水）溶血：向红细胞沉淀中加入蒸馏水2滴，摇匀，再加入滴，摇匀，再加入CCl42滴，充分摇匀，滴，充分摇匀， 4000rpm/分，离心分，离心3分钟分钟,取上清液备用。取上清液备用。v3. 电泳电泳v 1）膜条准备：提前）膜条准备：提前2小时把膜条浸泡在小时把膜条浸泡在浸膜缓冲液中待用。浸膜缓冲液中待用。v 2）点样：把膜条从缓冲液中取出，夹）点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在滤纸上（铺在滤纸上（毛面朝上毛面朝上），用小玻片沾取），用

8、小玻片沾取适量适量Hb液，按印于点样线上。液，按印于点样线上。v 3）电泳：在电泳槽内加入缓冲液，将）电泳：在电泳槽内加入缓冲液，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。膜条膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。膜条点样面向下，光滑面向上。点样的一端靠点样面向下，光滑面向上。点样的一端靠近负极。用浸泡在缓冲液中的纱布分别盖近负极。用浸泡在缓冲液中的纱布分别盖住膜条的两端，使膜条两端与缓冲液相连。住膜条的两端，使膜条两端与缓冲液相连。盖严电泳室，通电，平衡盖严电泳室，通电，平衡5-10分钟，调节分钟，调节电压为电压为100V，电泳，电泳30分钟。分钟。v 4）染色：电泳完毕后将膜条取下并放）染色：电泳完毕后

9、将膜条取下并放在丽春红染色液中浸泡在丽春红染色液中浸泡10 分钟。分钟。v4. 漂洗漂洗：将膜条从染色液中取出后放至漂：将膜条从染色液中取出后放至漂洗液中漂洗洗液中漂洗2-3次，使背景为白色即可，这次，使背景为白色即可，这样就得到清晰的电泳图谱。样就得到清晰的电泳图谱。v醋酸纤维素薄膜碱性电泳，正常醋酸纤维素薄膜碱性电泳，正常情况下可分离出情况下可分离出4条区带。它们分条区带。它们分别是：别是：（+）（-）v HbAHbA2CACAv观察膜条上观察膜条上Hb条带的位置及颜色的深条带的位置及颜色的深浅浅。v五、思考题：五、思考题：(Questions)v 电泳分离蛋白质的原理是什么？电泳分离蛋白

10、质的原理是什么？血红蛋白病：指珠蛋白肽链结构发生异变。异常血红蛋白：指珠蛋白链中一个或数个氨 基酸被置换、缺失或增加，造成血红蛋白结构及功能异常，导致一系列病理和生理改变。 人类异常血红蛋白高达两千多种类型，约300人中即有一人是异常血红蛋白携带者。因此，在临床上快速、早期诊断尤为重要。v醋酸纤维素薄膜电泳，为异常血红蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳，为异常血红蛋白的筛选、诊断提供了可靠的途径和依据。筛选、诊断提供了可靠的途径和依据。v地中海贫血即是异常血红蛋白的典型病例地中海贫血即是异常血红蛋白的典型病例.v一、实验目的一、实验目的 （Experimental Objectives）：）： 1. 掌

11、握血清脂蛋白测定的临床意义掌握血清脂蛋白测定的临床意义; 2.了解血清脂蛋白电泳的基本原理及操了解血清脂蛋白电泳的基本原理及操 作方法作方法。 1. 按电泳法分 乳糜微粒（CM） -脂蛋白 前-脂蛋白 -脂蛋白 乳糜微粒 (CM) ( 0.96 )极低密度脂蛋白（VLDL) (0.961.006)中间密度脂蛋白 (IDL) (1.0061.019)低密度脂蛋白 （LDL） (1.0191.063)高密度脂蛋白 （HDL） (1.0631.21) v血清中的脂类物质，都是以不同的比例与血清中的脂类物质，都是以不同的比例与蛋白质（载脂蛋白）结合成脂蛋白而存在。蛋白质（载脂蛋白）结合成脂蛋白而存在。

12、在在PH8.6的缓冲液中，脂蛋白均带负电荷，的缓冲液中，脂蛋白均带负电荷，在电场中移向正极。各种脂蛋白因其所带在电场中移向正极。各种脂蛋白因其所带有的电荷量以及颗粒大小、形状等不同，有的电荷量以及颗粒大小、形状等不同，在电场中泳动的速度也不一样，故可将其在电场中泳动的速度也不一样，故可将其分离，用不同方法显色便可以进行定性、分离，用不同方法显色便可以进行定性、定量分析。定量分析。v用琼脂糖凝胶作支持物进行电泳时，先将用琼脂糖凝胶作支持物进行电泳时，先将血清用苏丹黑血清用苏丹黑B（脂类染料）预染，使脂（脂类染料）预染，使脂蛋白着色，经电泳后可将血清脂蛋白分成蛋白着色，经电泳后可将血清脂蛋白分成三

13、条清晰的区带，可用光密度计扫描定量。三条清晰的区带，可用光密度计扫描定量。v1预染血清：预染血清：取小试管一只，加入血清取小试管一只，加入血清0.2ml及苏丹黑及苏丹黑B染料液染料液0.02ml，混匀后置，混匀后置于于37C水浴中预染水浴中预染30分钟备用。分钟备用。（这一步（这一步由老师提前做好，同学免做）由老师提前做好，同学免做）v2.制备琼脂糖胶板：制备琼脂糖胶板：0.45%的琼脂糖凝胶溶的琼脂糖凝胶溶解后，将凝胶溶液均匀灌注于制胶板上，厚解后，将凝胶溶液均匀灌注于制胶板上，厚约约0.5cm，静置约半小时后凝固。此时，小，静置约半小时后凝固。此时，小心取出上样梳，凝胶板上出现小凹槽即上样

14、心取出上样梳，凝胶板上出现小凹槽即上样孔。孔。v3.点样点样：用微量加样器吸取预染血清：用微量加样器吸取预染血清15l，注入上述凹槽内。注入上述凹槽内。v4.电泳电泳：将点样的凝胶板放于电泳槽中，：将点样的凝胶板放于电泳槽中，点样端置于负极，平衡点样端置于负极，平衡5分钟。接通电源，分钟。接通电源，调电压调电压100V，约，约45分钟，看到各区带已分分钟，看到各区带已分开，即可关掉电源，取出凝胶板。开，即可关掉电源，取出凝胶板。v肉眼观察各区带的颜色深浅宽窄及其肉眼观察各区带的颜色深浅宽窄及其v排列顺序，绘图记录之。排列顺序，绘图记录之。v1. 正常人血清脂蛋白琼脂糖电泳，可正常人血清脂蛋白琼

15、脂糖电泳，可分离出三条区带，从正极到负极依次分离出三条区带，从正极到负极依次为为-脂蛋白、前脂蛋白、前-脂蛋白和脂蛋白和-脂蛋白脂蛋白，原点处应无乳糜微粒。，原点处应无乳糜微粒。 2. 参考值：参考值：v -脂蛋白：脂蛋白：2030%v 前前-脂蛋白：脂蛋白：028.6%v -脂蛋白：脂蛋白：67%CMv正常人脂蛋白电泳谱上-脂蛋白含量 -脂蛋白含量前-脂蛋白。前-脂蛋白含量少时，在一般电泳谱上看不出来。正常人空腹血浆中虽有微量的乳糜微粒，但在一般电泳谱上也看不出来。v脂蛋白电泳结合其他血脂检查，对高脂血症的分型有很大参考价值。高脂蛋白血症的分型： CM 前 正常型a型b型型型型v简述血浆脂蛋白的分类、组成以简述血浆脂蛋白的分类、组成以及生理功能。及生理功能。