第十三章 DNA的生物合成课件.ppt

1、中心法则中心法则 (The Central Dogma)转转 录录翻翻 译译逆转录逆转录复复 制制1958年，年，F.Crick归纳了中心法则归纳了中心法则;1970年，年，H.Temin发现逆转录，补充了中心法则。发现逆转录，补充了中心法则。人类基因组计划人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)1986年年: Dulbecco R , 癌症研究的转折点癌症研究的转折点人类基因组的全序列分析人类基因组的全序列分析1990年年: “人类基因组计划人类基因组计划” 正式启动正式启动 1999年年:中国正式加入中国正式加入HGP并承担并承担1%的任务的任务2001年年2月月

2、:人类基因组草图表发表人类基因组草图表发表2003年年4月月:中、美、日、德、法、英等中、美、日、德、法、英等6国科学家宣布人类基因组国科学家宣布人类基因组计划完成计划完成 DNA的生物合成的生物合成( (复制复制) )DNA Biosynthesis，Replication 第第 十三十三 章章DNADNA复制的概况复制的概况Basic Rules of DNA Replication 第一节第一节复制复制( (replication)是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板按碱为模板按碱基配对的规律合成子链基配对的规律合成子链DNA的过程。发生于细胞分的过程。发生于

3、细胞分裂增殖时（裂增殖时（S S期）。期）。过程的研究一般采用三类系统：过程的研究一般采用三类系统：1) 1)以以 X174 DNA或质粒或质粒DNADNA及其完成复制所必及其完成复制所必需的酶、蛋白质及其因子构成的体外系统需的酶、蛋白质及其因子构成的体外系统2) 2)以以E.coli为模式生物，研究原核生物的复制为模式生物，研究原核生物的复制3) 3)以酵母和动物病毒为模式生物研究真核生物以酵母和动物病毒为模式生物研究真核生物的的DNADNA复制。复制。一、一、DNA的半保留复制的半保留复制半保留复制的概念半保留复制的概念亲代亲代DNA子代子代DNA子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承

4、母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 第一代第二代细菌（含15N-DNA)普通DNA普通DNA重DNA 重DNA普通培养基普通培养基细菌DNA双链密度梯度离心15N-DNA14N-DNA重DNA普通DNA按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA A的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的，即子代保留了亲代的全部遗全部遗传信息传信息，体现了遗传的，体现了遗传的保守性保守性。半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。二、二、DNA复

5、制的起点和方向复制的起点和方向原核生物复制中的放射自显影图象原核生物复制中的放射自显影图象 复制叉指的是复制叉指的是DNA双链解开分成两股，各自作双链解开分成两股，各自作为模板，子链延模板延长所需要形成的为模板，子链延模板延长所需要形成的Y字行结构。字行结构。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子

6、代DNA A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C环形环形DNADNA的的型复制型复制53oriorioriori535533553复制子复制子3复制子是独立完成复制的功能单位。复制子是独立完成复制的功能单位。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个定为一个复制子复制子(replicon) 。真核生物基因组庞大，有多个染色体。真核生物基因组庞大，有多个染色体。真核生物每个染色体有多个起始点，是多真核生物每个染色体有多

7、个起始点，是多复制子的复制。复制子的复制。真核生物有数以万计的复制子，长度差别真核生物有数以万计的复制子，长度差别很大，在很大，在13900K碱基对之间。碱基对之间。原核生物是单复制子完成复制，称复制体。原核生物是单复制子完成复制，称复制体。 真核生物真核生物DNA复制形成复制子的电镜照片复制形成复制子的电镜照片Electron Microscopy of replicating DNA revealsreplicating bubbles. 滚环复制滚环复制(rolling circle replication)是某些低等生物的复制形式，如是某些低等生物的复制形式，如 X174和和M13噬菌

8、体等。噬菌体等。其感染型的其感染型的DNA为单链，复制时为单链，复制时先形成闭合环状双链先形成闭合环状双链分子（复制型）分子（复制型），随后正链在受核酸内切酶活性的，随后正链在受核酸内切酶活性的protein A蛋白的作用下产生切口。蛋白的作用下产生切口。3OH延伸，保延伸，保持闭环的对应单链为模板，一边滚动一边进行连续的持闭环的对应单链为模板，一边滚动一边进行连续的复制。滚动的同时，外环复制。滚动的同时，外环5端逐渐离环向外伸出。完端逐渐离环向外伸出。完成一次复制后，成一次复制后，protein A把母链和子链切断把母链和子链切断3端沿母端沿母链延长，最后合成新的环状链延长，最后合成新的环状

9、DNA。滚环复制滚环复制形成单链形成单链分子分子n滚环复制的滚环复制的电镜照片电镜照片dNTPDNA-pol 取代环复制（取代环复制（D环复制，环复制，D-loop replication) 是线粒体是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。的复制形式。特点：复制起始点不在特点：复制起始点不在DNA同一位点，内、同一位点，内、外环复制有外环复制有 原核生物原核生物DNADNA的复制的复制第二节第二节参与参与DNA复制的物质复制的物质 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP， 总称总称dNTP聚合酶聚合酶(polymer

10、ase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，简写聚合酶，简写 为为 DNA-pol模板模板(template) : 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子以及以及无机离子无机离子(Mg2+)一、参与原核生物一、参与原核生物DNA复制的酶和蛋白质复制的酶和蛋白质（dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 复制的化学本质复制的化学本质单核苷酸的聚单核苷酸的聚合合pp pp pppPPPOHOHOH55PPiN1N2N3N1N2N3533 聚合反应的特

11、点聚合反应的特点DNA聚合酶聚合酶1. 53 的聚合活性的聚合活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除引物及突变的能切除引物及突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 （一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol Arthur Ko

12、rnberg（一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型聚合酶分为三型功能功能：对复制中的错误进行校读；对复制中的错误进行校读；对；对复制和修复中出现的空隙进行填补复制和修复中出现的空隙进行填补DNA-pol （109kD）AF 323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 GR 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行分子生物，进行分子生物学研究中常用的工具酶学研究中常用的工具酶

13、。 Klenow片段片段DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。 DNA复制的起点和方向复制的起点和方向 取代环复制（取代环复制（D环复制，环复制，D-loop replication) 滚环复制滚环复制(rolling circle replication)环形环形DNA的的型复制型复制 pol 与校读，修复有关与校读，修复有关l小片段小片段 5 3核酸核酸 外切酶活性外切酶活性l大片段大片段 （Klenow片段片段）聚合活性、）聚合活性、 3 5外切活性外切活

14、性 常用的工具酶常用的工具酶 pol 它参与它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。 原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 DNA-pol (250kD)10种亚基组成的不对称二聚种亚基组成的不对称二聚体体、组成核心酶组成核心酶，具有，具有53 的聚合活性和的聚合活性和 5 外切活性外切活性亚基亚基复制保真所必需复制保真所必需亚基亚基夹稳夹稳DNA模板，使酶沿模板，使酶沿模板滑动模板滑动-复合物（夹子装配复合物）复合物（夹子装配复合物） 促进全酶组装模板上，增强核促进全酶组装模板上，增强核心酶活性。心

15、酶活性。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol pol 与校读，修复有关与校读，修复有关l小片段小片段 5 3核酸核酸 外切酶活性外切酶活性l大片段大片段 （Klenow片段片段）聚合活性、）聚合活性、 3 5外切活性外切活性 常用的工具酶常用的工具酶 pol pol 真正起复制作用的酶真正起复制作用的酶 ，由，由10种种亚基组成的不对称二聚体，亚基组成的不对称二聚体，、组成组成核心酶核心酶l聚合活性、聚合活性、3 5外切活性外切活性原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶主要成员主要成员 主要作用主要作用解螺旋酶解螺旋酶(DnaB) 解开解开DNA双链双链SSB 维持已解开单

16、链维持已解开单链DNA的稳定的稳定引物酶引物酶 合成合成RNA引物引物 拓扑酶拓扑酶 使打结、缠绕、超螺旋的使打结、缠绕、超螺旋的DNA松驰松驰DNA连接酶连接酶 催化双链催化双链DNA中单链缺口的连接中单链缺口的连接（2 2）参与原核生物）参与原核生物DNADNA复制的其他酶和蛋复制的其他酶和蛋白质白质 E. Coli 基因图基因图目目 录录 引物酶引物酶(primase) ，DnaG复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物的酶引物的酶 在模板的复制起始部位催化在模板的复制起始部位催化NTP的聚合的聚合, 形成形成短片段的短片段的RNA。这一小段。这一小段RNA作为复制的引物，作为复制

17、的引物，提供提供3 -OH末端，使末端，使DNA-pol能够催化能够催化dNTP聚合。聚合。引物酶与引物酶与RNA聚合酶不同聚合酶不同 编码的基因不同编码的基因不同：rpoA D, rpoB C编码编码RNA-pol各各亚基；亚基； 对利福平的敏感度不同：对利福平的敏感度不同： RNA-pol敏感敏感DNA连接酶连接酶连接连接DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5 -P末端，末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连链连接成一条完整的链。接成一条完整的链。 DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式作用方式I.I. 噬菌体

18、和真核细胞的噬菌体和真核细胞的DNADNA连接酶由连接酶由ATPATP提供能量提供能量II.II.细菌的细菌的DNADNA连接酶由连接酶由NAD+NAD+提供能量提供能量POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATP或或NAD+AMP5353lDNA连接酶在复制中起最后接合切口的作用。连接酶在复制中起最后接合切口的作用。l在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合切口作用。修复、重组及剪接中也起缝合切口作用。l也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。功能功能Dna BDna C解链方向解链方向解螺旋酶解螺旋酶(helicase)，Dna B利用利用ATP供能供能

19、，作用于，作用于氢键氢键，使，使DNA双双链链解开解开成为两条单链成为两条单链DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 拓扑酶拓扑酶DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解解成单链，它才能起模板作用。成单链，它才能起模板作用。解链过程中，解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象，均需绕、连环等现象，均需DNA拓扑异构酶，改变拓扑异构酶，改变DNA分子构象，理顺分子构象，理顺DNA链，使复制能顺利进行。链，使复制能顺利进行。超螺旋的电镜照片超螺旋的电镜照片（质粒（质粒DNA）1010 8 8 局

20、部解链后局部解链后解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成拓扑异构酶拓扑异构酶（-蛋白）蛋白）切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态，从而改变超螺旋变为松弛状态，从而改变超螺旋的圈数。反应的圈数。反应不需不需ATP。可消除和减。可消除和减少负超螺旋，对正超螺旋不起作用。少负超螺旋，对正超螺旋不起作用。主要集中在转录区，与转录有关。主要集中在转录区，与转录有关。作用机制作用机制 拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点 既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶拓

21、扑异构酶（旋转酶）（旋转酶）切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过切链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。在利用口旋转使超螺旋松弛。在利用ATP供能扥情况下，连接断端，供能扥情况下，连接断端， DNA分分子进入负超螺旋状态，每作用一次子进入负超螺旋状态，每作用一次可引入可引入2个负超螺旋；在不消耗个负超螺旋；在不消耗ATP的情况下该酶可消除负超螺旋。的情况下该酶可消除负超螺旋。分布于染色质骨架蛋白和核基质部分布于染色质骨架蛋白和核基质部分，与复制有关。分，与复制有关。单链单链DNADNA结合蛋白（结合蛋白（single stranded DNA binding protein, SSB) ，

22、亦被称为亦被称为 螺旋反稳定螺旋反稳定蛋白蛋白在在E.coli由由177个氨基酸残基组成的四聚体，结个氨基酸残基组成的四聚体，结合单链合单链DNA的跨度约的跨度约32个核苷酸单位，作用时个核苷酸单位，作用时表现为协同作用。表现为协同作用。作用：作用：维持模板的单链状态；保护单链的完整维持模板的单链状态；保护单链的完整，防止核酸酶的降解，防止核酸酶的降解四种酶催化生成磷酸二酯键的比较四种酶催化生成磷酸二酯键的比较 酶酶 提供提供3-OH 3-OH 提供提供5-P 5-P 结果结果聚合酶聚合酶 引物和延长中的新链引物和延长中的新链 dNTP dNTP (dNMP)(dNMP)n+1n+1连接酶连接

23、酶 复制中不连续的单链复制中不连续的单链 单链单链 不连续不连续连续连续拓扑酶拓扑酶 切断后的链切断后的链 切断后的链切断后的链 改变改变 拓扑状态拓扑状态 引物酶引物酶 NTP NTP NTP NTP 合成引物合成引物 （一）复制的起始（一）复制的起始需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2. 形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3 -OH末端。末端。二、大肠杆菌二、大肠杆菌DNA复制的起始复制的起始E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG

24、 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 1. DNA解链解链20-40个个DnaA蛋白四聚体在蛋白四聚体在ATP参与下与参与下与oriC的的9bp重复序列结合。然后重复序列结合。然后DnaB蛋白四聚体在蛋白四聚体在DnaC蛋白的参与下和这个区域结合，蛋白的参与下和这个区域结合，DnaB具具有解螺旋酶的活性，

25、使其打开形成两个复制叉。有解螺旋酶的活性，使其打开形成两个复制叉。引发体引发体DanA 辨认复制起始点辨认复制起始点DnaB 解链解链DnaC 辅助解链辅助解链DnaG 合成引物合成引物DNA模板链复制起始区域模板链复制起始区域引发体（引发体（primosome）含有解螺旋酶含有解螺旋酶DnaB 、DnaC蛋蛋白、引物酶和白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发复制起始区域的复合结构称为引发体。体。 引发体和引物引发体和引物 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和D

26、NA复制复制起始区域的复合结构称为引发体。起始区域的复合结构称为引发体。 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶II通过切断，旋转，再连接，实通过切断，旋转，再连接，实现现DNA超螺旋转型，在复制整个过程都需要超螺旋转型，在复制整个过程都需要.3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。十几或数分子。十几或数十个核苷酸组成，十个核苷酸组成，53合成。合成。引物引物3 HO5引物引物酶酶（三）复制的延长（三）复制的延长复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其

27、化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 DNA DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸结合聚合酶催化游离的脱氧核苷酸结合到新链到新链33末端，使其不断延长。末端，使其不断延长。 5 5 3 35 5DNA-polDNA-pol DNA-polDNA-poldATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP复制的半不连续性复制的半不连续性3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 3 3 5 领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)l顺着解链方向生成的子链，复制是顺着解链方向生成的子链，复制是连续连续进行的，进行的，

28、这股链称为这股链称为前导链前导链，或，或领头链领头链。l另一股链因为复制的方向与解链另一股链因为复制的方向与解链方向相反方向相反，不能，不能顺着解链方向连续延长，这股顺着解链方向连续延长，这股不连续不连续复制的链称复制的链称为为后随链，后随链，随从链随从链。1968年，岡崎发现了复制中年，岡崎发现了复制中的不连续片段，称为的不连续片段，称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment，包含，包含RNA引物片段引物片段)。 l领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的的半不连续性半不连续性。 领头链的合成领头链的合成随从链的合成随从链的合成n同一

29、复制叉上领同一复制叉上领头链和随从链由头链和随从链由相同的相同的DNA-pol催化延长催化延长 Figure 8-21* Trombone model复复制制过过程程简简图图 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段，双向复制的复制片段在复制的终止子在复制的终止子(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（四）复制的终止过程：切除引物、填补（四）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口空缺、连接切口terG大肠杆菌的顺时针复制叉有4个连续排列的终止子的终止序列；逆时针复制叉有3个连续排列的终止子，当复制叉移动到终止子处，

30、被称作终点利用物质（Tus)的蛋白质会结合在ter序列上，阻止复制叉的移动。5 5 5 DNA-pol OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接DNA复制完成后两个子代分子以连环体的复制完成后两个子代分子以连环体的形式存在，需要由形式存在，需要由TOPO IV将其中的一个将其中的一个环状分子切开，使两个子代分子脱离后再环状分子切开，使两个子代分子脱离后再将其切开的将其切开的DNA连接成环状的分子。连接成环状的分子。 小小 结结主要成员主要成员 主要作用主要作用DnaA DnaA 识别复制起始

31、位点识别复制起始位点解螺旋酶解螺旋酶(DnaB) (DnaB) 解开解开DNADNA双链双链SSB SSB 维持已解开单链维持已解开单链DNADNA的稳定的稳定引物酶引物酶 合成合成RNARNA引物引物 TOPOII TOPOII 使打结、缠绕、正超螺旋的使打结、缠绕、正超螺旋的DNADNA松驰松驰DNA-pol DNADNA-pol DNA复制复制DNA-pol DNA-pol 水解引物、填补空隙、修复作用水解引物、填补空隙、修复作用DNADNA连接酶连接酶 催化双链催化双链DNADNA中单链缺口的连接中单链缺口的连接终点利用物质（终点利用物质（Tus)Tus) 使复制叉的移动终止在终止子处

32、使复制叉的移动终止在终止子处TOPOIV TOPOIV 切开两个子代分子连环体形式切开两个子代分子连环体形式第三节第三节 真核生物真核生物DNA的复制的复制真核生物复制的基本过程与原核基本相似真核生物复制的基本过程与原核基本相似真核生物每个染色体有多个起始点，是真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。多复制子复制。复制有时序性，即复制子复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。以分组方式激活而不是同步起动。 有关真核生物有关真核生物DNA复制的资料主要来源复制的资料主要来源于于SV40病毒和酵母的研究。病毒和酵母的研究。（一）常见的真核细胞的（一）常见的真核细胞的DNADNA

33、聚合酶有五种聚合酶有五种DNA-pol 起始引发，有引物酶活性起始引发，有引物酶活性, ,可催化可催化RNARNA链的合成。链的合成。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。(DNA-pol III)(DNA-pol III)参与低保真度的复制。参与低保真度的复制。在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen, PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为

34、同源三聚体，具有与为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶聚合酶的的亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的环形的可滑动可滑动DNA夹子夹子，在，在RFC（相当于相当于-复合复合物物）的作用下的作用下PCNA结合于引物模板链；并且结合于引物模板链；并且PCNA使使pol获得持续合成能力。获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。水平也是检验细胞增殖的重要指标。在复制叉形成，在复制叉形成， pol 合成合成RNA引物及引物及20nt-30nt的的 DNA生成后，生成后， DNA-pol / 通过通过PCNA的协同作用，逐步取代的协

35、同作用，逐步取代pol ，在，在RNA引物的引物的3 -OH基础上合成领头链和随从基础上合成领头链和随从链。链。DNA-pol 填补。填补。 小小 结结主要成员主要成员 主要作用主要作用DnaA DnaA 识别复制起始位点识别复制起始位点解螺旋酶解螺旋酶(DnaB) (DnaB) 解开解开DNADNA双链双链SSB SSB 维持已解开单链维持已解开单链DNADNA的稳定的稳定引物酶引物酶 合成合成RNARNA引物引物 TOPOII TOPOII 使打结、缠绕、正超螺旋的使打结、缠绕、正超螺旋的DNADNA松驰松驰DNA-pol DNADNA-pol DNA复制复制DNA-pol DNA-pol

36、 水解引物、填补空隙、修复作用水解引物、填补空隙、修复作用DNADNA连接酶连接酶 催化双链催化双链DNADNA中单链缺口的连接中单链缺口的连接终点利用物质（终点利用物质（Tus)Tus) 使复制叉的移动终止在终止子处使复制叉的移动终止在终止子处TOPOIV TOPOIV 切开两个子代分子连环体形式切开两个子代分子连环体形式真核生物复制的基本过程与原核基本相似真核生物复制的基本过程与原核基本相似（一）常见的真核细胞的（一）常见的真核细胞的DNADNA聚合酶有五种聚合酶有五种DNA-pol 起始引发，有引物酶活性起始引发，有引物酶活性, ,可催化可催化RNARNA链的合成。链的合成。延长子链的主

37、要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。(DNA-pol III)(DNA-pol III)参与低保真度的复制。参与低保真度的复制。在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（proliferation cell proliferation cell nuclear antigen, PCNAnuclear antigen, PCNA）在复制起始和延在复制起始和延长中起关键作用。长中起关键作用。（一）（一）SV40DNA的复制的复制 SV40（simian sarcom

38、 avirus40 猴猴肉瘤病毒肉瘤病毒)属乳多空病毒类，是最小的属乳多空病毒类，是最小的DNA病毒之一。它可长期潜伏于猴肾细胞，对病毒之一。它可长期潜伏于猴肾细胞，对新生仓鼠有致癌性，体外试验还可使多种新生仓鼠有致癌性，体外试验还可使多种属细胞恶性转化。属细胞恶性转化。反应主要步骤包括：反应主要步骤包括：1 1）2 2分子分子T T抗原六聚体作为起始蛋白在抗原六聚体作为起始蛋白在ATPATP的存在下与其复制起始区结合并解链。的存在下与其复制起始区结合并解链。2 2）复制蛋白（）复制蛋白（RPARPA，其作用类似，其作用类似SSBSSB）, ,结结合单链区，进一步提高合单链区，进一步提高T T

39、抗原的解旋酶活性。抗原的解旋酶活性。但其作用时无协同效应。但其作用时无协同效应。3 3） pol pol 与与T T抗原抗原/RPA/RPA复合物结合，生成复合物结合，生成前导链引物及前导链引物及20nt-30nt20nt-30nt的的 DNADNA。4 4）复制因子（）复制因子（RFCRFC）先与新合成的）先与新合成的DNA3DNA3端结合，端结合，随后随后PCNAPCNA取代取代pol pol 结合到结合到DNADNA模板上，前导链合模板上，前导链合成暂时中断。成暂时中断。5 5） DNA-pol DNA-pol / / 结合到结合到PCNA-RFCPCNA-RFC复合物上，持复合物上，持

40、续准确的合成前导链；同时，续准确的合成前导链；同时， pol pol 结合到后随结合到后随链的模板上开始其后随链的合成。后随链的延伸，链的模板上开始其后随链的合成。后随链的延伸，也需要也需要PCNA- DNA-pol PCNA- DNA-pol / / 取代取代pol pol 6 6）FEN-1-RNase H1FEN-1-RNase H1负责切除引物，负责切除引物，DNADNA连接酶连接酶 I I负责连接片段，拓扑异构酶负责连接片段，拓扑异构酶 I I负责清除正超螺旋，负责清除正超螺旋，拓扑异构酶拓扑异构酶 IIII负责解开连体环。负责解开连体环。Type II topoisomerases

41、 are required to separate daughter DNA moleculesFinishing replication细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S期及期及M期这两期这两个关键点。个关键点。G1S及及G2M的调节，与蛋的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制活或抑制pre-RC而实施调控作用。相关的而实施调控作用。相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白(cyclin)，和催化亚基即和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶细胞周期蛋白依赖激酶(Cdk)和另一种蛋白激酶和另一种蛋白激酶(

42、Ddk) 。 Cdk和和Ddk可以使可以使pre-RC的的pre-RC， DNA-DNA-pol pol / / 在一些辅助蛋白的协助下被募集在一些辅助蛋白的协助下被募集到到pre-RC上，接着募集上，接着募集pol -pol -引物酶，从引物酶，从而确保在合成而确保在合成RNARNA引物前，合成前导链和后引物前，合成前导链和后随链的酶已经到位。随链的酶已经到位。Cdk可以激活可以激活pre-RC，同时抑制形成新的，同时抑制形成新的pre-RC，从而确保，从而确保DNA在一个细胞周期只在一个细胞周期只合成一次。合成一次。在细胞完成分裂后，在细胞完成分裂后，Cdk即被分解。即被分解。哺乳动物的哺

43、乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SM细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S期及期及M期这两个关期这两个关键点。键点。G1S及及G2M的调节，与蛋白激酶活的调节，与蛋白激酶活性有关。性有关。 （二）原核生物和真核生物（二）原核生物和真核生物DNADNA复制的主要复制的主要差别差别1 1）原核单复制子的复制，真核多复制子的复）原核单复制子的复制，真核多复制子的复制，真核的复制子小。制，真核的复制子小。2 2）原核的复制叉移动速度）原核的复制叉移动速度900nt900nt，真核的仅，真核的仅为为50nt50nt。3 3）原核的冈崎片段）原核的冈崎片段1000-2000n

44、t1000-2000nt，真核的仅，真核的仅为为100-200nt100-200nt。4 4）真核的）真核的DNADNA聚合酶和蛋白质因子种类比原聚合酶和蛋白质因子种类比原核细胞多，引物酶活性由聚合酶核细胞多，引物酶活性由聚合酶a a的两个亚的两个亚基承担（引物包含小片段的基承担（引物包含小片段的DNADNA）5 5）原核细胞在第一轮复制还没结束的时候，）原核细胞在第一轮复制还没结束的时候，就可以在复制起始区启动第二轮复制，真就可以在复制起始区启动第二轮复制，真核细胞的复制在有核细胞的复制在有复制许可因子复制许可因子的控制下，的控制下，复制周期不可重叠。复制周期不可重叠。6 6）原核生物的）原

45、核生物的DNADNA为环形分子，为环形分子，DNADNA复制不存复制不存在末端会缩短的问题。真核生物在末端会缩短的问题。真核生物DNADNA为线性为线性分子，分子，DNADNA复制时末端会缩短，需要复制时末端会缩短，需要端粒酶端粒酶解决线性解决线性DNADNA末端问题。末端问题。 小小 结结主要成员主要成员 主要作用主要作用DnaA DnaA 识别复制起始位点识别复制起始位点解螺旋酶解螺旋酶(DnaB) (DnaB) 解开解开DNADNA双链双链SSB SSB 维持已解开单链维持已解开单链DNADNA的稳定的稳定引物酶引物酶 合成合成RNARNA引物引物 TOPOII TOPOII 使打结、缠

46、绕、正超螺旋的使打结、缠绕、正超螺旋的DNADNA松驰松驰DNA-pol DNADNA-pol DNA复制复制DNA-pol DNA-pol 水解引物、填补空隙、修复作用水解引物、填补空隙、修复作用DNADNA连接酶连接酶 催化双链催化双链DNADNA中单链缺口的连接中单链缺口的连接终点利用物质（终点利用物质（Tus)Tus) 使复制叉的移动终止在终止子处使复制叉的移动终止在终止子处TOPOIV TOPOIV 切开两个子代分子连环体形式切开两个子代分子连环体形式RPARPA染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的复制中岡崎片段的连接，

47、复制子之间的连接。连接。染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。引物，去除后留下空隙。（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 端粒端粒(telomere)指指真核生物真核生物染色体线性染色体线性DNA分子末端（膨大成分子末端（膨大成粒状）的结构。粒状）的结构。结构特点结构特点 由染色体末端由染色体末端DNA和蛋白紧密结合。和蛋白紧密结合。 其中一条链末端其中一条链末端DNA序列是多次重复的富序列是多次重复的富含含G、T碱基的短碱基的短 序列，叫序列，叫

48、TG链链;另一条叫另一条叫AC链。链。TTTTGGGGTTTTGGGGAAAACCCCAAAACCCC这些重复序列的少量丢失，不会伤及基因这些重复序列的少量丢失，不会伤及基因的结构。但若端粒缩减到一定程度，细胞的结构。但若端粒缩减到一定程度，细胞会停止分裂。会停止分裂。功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性人类染色体端粒人类染色体端粒DNADNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶端粒酶RNA :有一段序列与端粒有一段序列与端粒TG链突出的链突出的3末端末端互补。互补。端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白端粒酶逆

49、转录酶端粒酶逆转录酶 组成组成RNA-蛋白质复合物蛋白质复合物 端粒酶端粒酶RNA含有与端粒区重复序列含有与端粒区重复序列(TnGn)x相似及互补的序列相似及互补的序列(AnCn)x ，端，端粒酶以自身的粒酶以自身的RNA为模板延长为模板延长DNA单链，单链，然后反折为双链，提供了然后反折为双链，提供了3-OH与与DNA复制的模板复制的模板爬行模式。爬行模式。端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬行模型爬行模型Inchworm model内内在在模模板板RNA逆转录，延长母链逆转录，延长母链DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工端粒与端粒酶是当今的一个研究热点端粒与端

50、粒酶是当今的一个研究热点20092009年度诺贝尔生理学或医年度诺贝尔生理学或医学奖揭晓，得主是三位美学奖揭晓，得主是三位美国科学家伊丽莎白布赖国科学家伊丽莎白布赖克本（克本（Elizabeth Elizabeth H.BlackburnH.Blackburn）、卡罗尔）、卡罗尔格雷德（格雷德（Carol W.GreiderCarol W.Greider）和杰克绍斯塔克（和杰克绍斯塔克（Jack Jack W.SzostakW.Szostak），他们的研究），他们的研究主题是主题是“染色体如何受染色体如何受到端粒和端粒酶的保到端粒和端粒酶的保护护” ” 3 5 5 3 领头链领头链3 5 3