第十章DNA的生物合成（复制）tianx1课件.ppt

1、1第第 三三 篇篇 基因信息的传递基因信息的传递2Watson、Crick的DNA双螺旋结构 Watson and Crick， 1953人类科学发展历史上人类科学发展历史上的伟大里程碑。的伟大里程碑。4基因的概念与发展基因的概念与发展基基 因因: : 指编码蛋白质多肽链或各种指编码蛋白质多肽链或各种RNARNA的的DNADNA功能片段。功能片段。基因组基因组: : 一个细胞或病毒颗粒所含全部遗传一个细胞或病毒颗粒所含全部遗传信息的总和。信息的总和。 5从从DNADNA到蛋白质，遗传信息的流动到蛋白质，遗传信息的流动都遵循着都遵循着中心法则中心法则。中心法则中心法则6基因表达基因表达基因表达基

2、因表达逆转录逆转录7第第10章章 DNA的生物合成的生物合成（复（复 制）制）DNA Biosynthesis（Repication）89v复制复制( (replication)是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板为模板合成子链合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA复复 制制 的的 概概 念念10本章主要内容本章主要内容 复制的基本规律复制的基本规律 DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化 复制的过程复制的过程 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式 DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复11复制的基本规律复制的基本规律

3、Basic Rules of DNA Replication 第一节第一节12 复制的方式复制的方式半保留复制半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication) 复制的基本规律复制的基本规律13一、半保留复制一、半保留复制1、概念、概念 D N A 生 物 合 成 时 ， 母 链生 物 合 成 时 ， 母 链DNA解开为两股单链，各自作解开为两股单链，各自作为模板为模板(template)按碱基配对规按碱基配对规

4、律，合成与模板互补的子链。子律，合成与模板互补的子链。子代细胞的代细胞的DNA，一股单链从亲，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代都和亲代DNA碱基序列一碱基序列一致。这种复制方式称为致。这种复制方式称为半保留复半保留复制。制。14AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTG

5、ACC+母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA15 按半保留复制方式，按半保留复制方式，子代子代DNA与亲代与亲代DNA的的碱基序列一碱基序列一致致，即子代保留了，即子代保留了亲代的全部遗传信亲代的全部遗传信息，体现了遗传的息，体现了遗传的保守性保守性。 遗传的保守性，遗传的保守性，是物种稳定性的分是物种稳定性的分子基础，但子基础，但不是绝不是绝对的对的。2、半保留复制的意义、半保留复制的意义16 二、双向复制二、双向复制 原核生物复制时，原核生物复制时，DNADNA从起始点从起始点(origin)(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复向两个

6、方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为制叉，称为双向复制双向复制。 复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象17真核生物每个染色体有多个起始点，真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子定为一个复制子(replicon) (replicon) 。复制子是独。复制子是独立完成复制的功能单位。立完成复制的功能单位。 53oriorioriori531853oriorioriori535533553复制子复制子319三、复制的半不连续性三、复制的半不连续性3 5 3 5 解链方向解链方向

7、3 5 3 3 5 领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)20 DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化The Enzymology and Topology of DNA Replication第二节第二节21参与参与DNADNA复制的物质复制的物质 底物底物(substrate): (substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶聚合酶(polymerase): (polymerase): 依赖依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶，简聚合酶，简 写为写为 DNA-pol 模板模板(template)

8、 : (template) : 解开成单链的解开成单链的DNADNA母链母链 引物引物(primer): (primer): 提供提供3 3 -OH-OH末端使末端使dNTPdNTP可以依次可以依次 聚合聚合 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子22(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键是复一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应制的基本化学反应23v聚合反应的特点聚合反应的特点lDNA DNA 新链生成需新链生成需引物和模板引物和模板； l新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 5 3 3 方向方向进行。进行。24参

9、与复制的主要酶类参与复制的主要酶类 DNA聚合酶聚合酶 解链解旋酶解链解旋酶 引物酶引物酶 DNA连接酶连接酶25全称：全称：依赖依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent (DNA-dependent DNA polymerase)DNA polymerase)简称：简称：DNA-polDNA-pol活性：活性：1. 51. 53 3 的聚合活性的聚合活性2. 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性二、二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合聚合酶催化核苷酸之间聚合26 3 3 5 5 外切酶活性外切酶活性：能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解

10、。 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 5 5 3 3 外切酶活性：外切酶活性：能切除能切除RNA引物和突变的引物和突变的 DNA片段。片段。? 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 271 1、原核生物的、原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 可可能能不不可可能能可可能能基基因因突突变变后后的的致致死死性性无无无无有有5 3 核核酸酸外外切切酶酶活活性性20？400分分子子数数/细细胞胞多多亚亚基基不不对对称称二二聚聚体体？

11、单单肽肽链链组组成成250120109分分子子量量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I可可能能不不可可能能可可能能基基因因突突变变后后的的致致死死性性无无无无有有5 3 核核酸酸外外切切酶酶活活性性20？400分分子子数数/细细胞胞多多亚亚基基不不对对称称二二聚聚体体？单单肽肽链链组组成成250120109分分子子量量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I28 对复制中的错误进行校读，对复制和修复对复制中的错误进行校读，对复制和修复 中出现的空隙进行填补。中出现的空隙进行填补。DNA-pol （109kD）n功能：功能：29323个

12、氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进，进行分子生物学研究中常用的工具酶。行分子生物学研究中常用的工具酶。 30 53聚合酶活性聚合酶活性 35外切酶活性外切酶活性 无无53外切酶活性外切酶活性 DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发对模板的特异性不高，即使在已发

13、生损伤的生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，因此认为，它参与它参与DNA损伤的应急状态修复损伤的应急状态修复。DNA-pol （120kD）31DNA-pol (250kD)n功能：功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。322 2、真核生物的、真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修

14、复和填补缺口的作用。口的作用。在线粒体在线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 33三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据功能是复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：复制保真性的酶学机制：（1）核酸外切酶活性和及时校读核酸外切酶活性和及时校读 （2 2）复制的保真性依赖正确的碱基选择）复制的保真性依赖正确的碱基选择34（1）核酸外切酶活性在复制中辨认

15、切除）核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正错配碱基并加以校正核酸外切酶核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。酶是有方向性的。 35DNA-polDNA-pol的校读功能的校读功能A A：DNA-polDNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。入正确配对的底物。B B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-polDNA-pol不表现活性。不表现活性。36（2 2）复制的保真性依赖正确碱基选择）复制

16、的保真性依赖正确碱基选择 碱基配对的关键在于氢键的形成。碱基配对的关键在于氢键的形成。 酶通过对不同碱基构型亲和力不同实现其选择作用。酶通过对不同碱基构型亲和力不同实现其选择作用。371. 1. 遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2. 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3. 3. 复制出错时复制出错时DNA-polDNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。v DNADNA复制的保真性至少要依赖三种机制复制的保真性至少要依赖三种机制 38四、复制中的分子解链及四、复制中的分子解链及DNA DNA 分子拓扑学变化分子拓扑学变化 DNAD

17、NA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNADNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。39理理顺顺DNA链链拓拓扑扑异异构构酶酶 (gyrA, B)稳稳定定已已解解开开的的单单链链单单链链DNA结结合合蛋蛋白白SSB催催化化RNA引引物物生生成成引引物物酶酶DnaG (dnaG)运运送送和和协协同同DnaBDnaC (dnaC)解解开开DNA双双链链解解螺螺旋旋酶酶DnaB (dnaB)辨辨认认起起始始点点DnaA (dnaA)蛋蛋白白质质（基基因因）通通用用名名功功能能原原核核生生物物复复制制起起始始的的相相关关蛋蛋白白质质（一）多种酶参与（

18、一）多种酶参与DNA解链和稳定单解链和稳定单链状态链状态40解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供供能，作用于氢键，使能，作用于氢键，使DNA双链解开成双链解开成为两条单链。为两条单链。41 DNA聚合酶不能从头合成聚合酶不能从头合成DNA链，只能延长已有的链，只能延长已有的DNA或或RNA引物链。引物链。 引物酶引物酶（primase）在复制起始时催化）在复制起始时催化引物引物（primerprimer）合成，合成，提供提供3 3 - -OHOH末端，使末端，使DNA-polDNA-pol能够催化能够催化dNTPdNTP聚合。聚合。 引物酶属引物酶属DNA指导的指导的RNA 聚

19、合酶，但不同于催化转聚合酶，但不同于催化转录过程的录过程的RNA聚合酶。在聚合酶。在E.coli，引物酶是，引物酶是dnaG基基因的产物因的产物DnaG。引物酶引物酶(primase) 复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物的酶引物的酶42 单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（single stranded DNA binding protein，SSB） 的作用是在复制中维持模板处于单的作用是在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。链状态并保护单链的完整。 模板的模板的DNA总要处于单链状态，而总要处于单链状态，而DNA分子只要符合分子只要符合碱墓配对，又总会有形成双链的倾向，以

20、使分子达到碱墓配对，又总会有形成双链的倾向，以使分子达到稳定状态和免受胞内广泛存在的核酸酶降解。稳定状态和免受胞内广泛存在的核酸酶降解。单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整护单链的完整。 431010 8 8 局部解链后局部解链后DNA拓扑异构酶（拓扑异构酶（DNAtopoisomerase）改变改变DNA超螺旋状态、理顺超螺旋状态、理顺DNA链链复制过程正超螺旋的形成：复制过程正超螺旋的形成：44解链过程中，解链过程中，DNADNA分子会

21、过度拧分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。紧、打结、缠绕、连环等现象。45拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过切口链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能供能，连接断端，连接断端， DNA分子分子进入负超螺旋状态。进入负超螺旋状态。作用机制作用机制 拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶作用特点： 既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接

22、磷酸二酯键47DNADNA连接酶连接酶(DNA ligase) (DNA ligase) 连接连接DNA双链中双链中的单链缺口的单链缺口连接连接DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5 -P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。作用方式作用方式48POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPADP535349DNADNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在在DNADNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起

23、缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。功能功能50DNA生物合成过程生物合成过程The Process of DNA Replication第三节第三节51（一）复制的起始（一）复制的起始: : DNA解链形成引发体解链形成引发体需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA1. DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2. 2. 合成引物，提供合成引物，提供3 3 -OH-OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNADNA生物合成生物合成 52E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT

24、 GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 24558 66 166 174 201 209 245 串联重复序串联重复序列列 反向重复序反向重复序列列5 3 5 3 1. DNA1. DNA解链解链DNADNA生物合成过程生物合成过程53 原核生物复制的起始示意图原核生物复制的起始示意图54 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 2. 引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaCDnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNADNA复制复制起始区域的复合结构称为起始区域的复合结构称为引发体引发体。