第13章DNA的生物合成-复制 Microsoft PowerPoint 演示文稿课件.ppt

1、基因基因Gene 19091909年、年、约翰逊（丹麦）约翰逊（丹麦） JohannsenJohannsen提出提出19441944年（年（1877-19551877-1955），美国），美国O.T.Avery(O.T.Avery(艾弗里）艾弗里）证明了证明了DNADNA是遗传物质。是遗传物质。19531953年年Watson and CrickWatson and Crick，发现，发现DNADNA的双螺旋的双螺旋结构。结构。基因是基因是DNADNA大分子中的各个功能片段，含有控制生大分子中的各个功能片段，含有控制生物性状、发育的全部遗传信息。物性状、发育的全部遗传信息。l人类的基因人类的基

2、因 约约3.53.5万个。万个。l基因分类：基因分类：l结构基因：编码蛋白质结构基因：编码蛋白质 1%1%l调节基因：调节基因表达。调节基因：调节基因表达。l插入序列、重复序列：插入序列、重复序列：中心法则（中心法则（1958年）年）DNA RNA 蛋白质转录翻译复制 美国癌症学会传染性肿瘤学和细胞生物学教授美国癌症学会传染性肿瘤学和细胞生物学教授Howard Howard TeminTemin和加州理工学院的教授和加州理工学院的教授David BaltimoreDavid Baltimore于于19701970年在年在鸡肉瘤中发现了逆转录酶，发展了中心法则。于鸡肉瘤中发现了逆转录酶，发展了中

3、心法则。于19751975年获年获得诺贝尔奖。得诺贝尔奖。中心法则中心法则 Central DogmaCentral DogmaRNARNADNADNA蛋白质蛋白质转录翻译复制逆转录少数病毒复制翻译翻译 蛋白质蛋白质（病毒）（病毒）1.1.以以DNADNA为模板指导合成为模板指导合成DNADNA的过程的过程 复制复制2.2.以以DNADNA为模板指导合成为模板指导合成RNARNA的过程的过程 转录转录3.3.以以mRNAmRNA为模板指导合成蛋白质的过程为模板指导合成蛋白质的过程 翻译翻译4.4.以以RNARNA为模板指导合成为模板指导合成DNADNA的过程的过程 反转录反转录5.5.以以RN

4、ARNA为模板指导合成为模板指导合成RNARNA的过程的过程 复制复制要点：要点：甲流病毒结构图片甲流病毒结构图片禽流感？猪流感？禽流感？猪流感？从从19181918到到20092009新流新流感的秘密感的秘密 复制复制( (replication)是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链为模板合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA本章主要内容：本章主要内容：复制的基本规律复制的基本规律DNA复制酶学和拓扑学变化复制酶学和拓扑学变化DNA的复制过程的复制过程反转录和其他的复制方式反转录和其他的复制方式DNA的损伤和修复的损伤和修复第一

5、节第一节 复制的基本规律复制的基本规律l一、半保留复制一、半保留复制 (semiconservative replication)l二、双向复制二、双向复制 (bidirectional replication) 三、半不连续复制三、半不连续复制 (semi-discontinuous replication)四、四、复制的高保真性复制的高保真性复制的特征复制的特征半保留复制半保留复制复制的高保真性复制的高保真性起始位点起始位点双向复制双向复制半不连续性复制半不连续性复制一一 、半保留复制、半保留复制 1.1.概念：概念：DNADNA生物合成时，生物合成时，母链母链DNADNA解开为两股单链，

6、各自解开为两股单链，各自作为模板，按碱基配对规律，合作为模板，按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。成与模板互补的子链。 子代细胞的子代细胞的DNADNA，一股单链从，一股单链从亲代完整接受过来，另一股单链亲代完整接受过来，另一股单链是新合成的，两个子细胞的是新合成的，两个子细胞的DNADNA都和亲代都和亲代DNADNA碱基序列一致，碱基序列一致，这这种复制方式为半保留复制。种复制方式为半保留复制。归纳：半新半旧归纳：半新半旧2. 2. 实验依据：实验依据： 密度梯度实验密度梯度实验 （Meselson and Stahl） 1958 Matthew 1958 Matthew Meselson

7、Meselson和和Franklin Franklin StahlStahl美国科学家马修美国科学家马修. .梅塞尔梅塞尔( (Matthew Matthew Keelson)Keelson)福兰克林福兰克林. .斯塔尔斯塔尔( (Franklin Stahl)Franklin Stahl) 1957 1957年，梅塞尔和斯塔尔在加年，梅塞尔和斯塔尔在加州工学院工作期间，利用大肠杆菌州工学院工作期间，利用大肠杆菌研究遗传物质研究遗传物质DNADNA。他们先将大肠。他们先将大肠杆菌放入含有杆菌放入含有N15N15的培养基中标培的培养基中标培养，然后将这些大肠杆菌转移到养，然后将这些大肠杆菌转移到

8、N14N14的培养基中培养，最后把大肠的培养基中培养，最后把大肠杆菌经密度梯度离心。他们发现提杆菌经密度梯度离心。他们发现提取的取的DNADNA有三条带。有三条带。密度梯度实验密度梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想的设想含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌 （15代代)培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代(20min(20min，杂合体，杂合体) )继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果重重DNA普通普通 DNA电镜观察电镜观察DNA复制复制 按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNADNA与亲代与亲代DNADNA

9、的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的信息，体现了遗传的保守性保守性。半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。原核生物原核生物复制时，复制时，DNADNA从起始点从起始点(origin)(origin)向两个方向解链，形成两个向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。制。 复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象二、二、 双向复制双向复制(bidirectional (bidirect

10、ional replication)replication)A. A. 环状双链环状双链DNADNA及复制起始点及复制起始点B. B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. C. 复制接近终止点复制接近终止点oriterA B C原核生物原核生物DNA双向复制双向复制归纳：归纳：1 1个复制点个复制点2 2个复制叉个复制叉4 4条链同时合成条链同时合成原核生物约原核生物约3 310106 6个个bpbp，每秒合成，每秒合成25002500个个bpbp，才能，才能2020分钟繁殖一代。分钟繁殖一代。人是人是6 610109 9个个bpbp，每秒合成，每秒合成100100个个bpbp，实际时间

11、约实际时间约8 8个小时。个小时。真核生物每个染色体有多个起始点，是真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子多复制子的复制。的复制。习惯上把两个相邻习惯上把两个相邻起始点之间的距离起始点之间的距离定为一个定为一个复复制子制子(replicon(replicon) ) 。复制子是独立完成复制的功能单位。复制子是独立完成复制的功能单位。人类约人类约10001000个个bpbp即有即有1 1个复制起点。个复制起点。 真核生物真核生物多复制子的复制多复制子的复制53oriorioriori535533553复制子复制子3真核生物真核生物DNA多复制子复制多复制子复制多个起始点多个起始点三、复制的半不

12、连续性三、复制的半不连续性3 3 5 5 3 3 5 5 解链方向解链方向3 3 5 5 3 3 3 3 5 5 领头链领头链(leading strand)(leading strand)随从链随从链(lagging strand)(lagging strand)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为这股链称为领头链领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为为随从链随从链。复制中的不连续片段称为。复制中

13、的不连续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki(okazaki fragment) fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的的半不连续性半不连续性。 3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 3 3 5 领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)1. 1. 遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2. 2. 聚合酶对碱基的选择功能；聚合酶对碱基的选择功能；3. 3. 复制出错时复制出错时DNA-polDNA-pol的及时校

14、读功能。的及时校读功能。四、四、DNADNA复制的保真性至少要依赖三种机制复制的保真性至少要依赖三种机制 DNA复制的复制的保真性至少依保真性至少依赖于三种机制赖于三种机制复制出错时复制出错时及时校读及时校读聚合酶对碱聚合酶对碱基的选择性基的选择性严格的碱基配对严格的碱基配对第二节第二节 参与参与DNADNA复制的复制的 主要酶类和蛋白因子主要酶类和蛋白因子1. 1. 模板：解开成单链的模板：解开成单链的DNADNA母链母链3-53-53. DNA3. DNA聚合酶，聚合酶，DNA-polDNA-pol2. 2. 底物底物dNTP dNTP ：dATPdATP，dGTPdGTP，dCTPdCT

15、P，dTTP dTTP 4. 4. 引物（引物（primerprimer）：）：RNARNA引物引物 NTPNTP5. 5. 其他酶和蛋白质因子其他酶和蛋白质因子一、参与一、参与DNA复制的物质复制的物质 二、复制的化学反应二、复制的化学反应 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 5533CGA生成磷酸二酯键生成磷酸二酯键N N1 1OHOH3355+d+dN N2 2TPTPN N1 1N N2 2-OH-OH3355+PPi+PPiDNA polDNA pol33TAGAAGACCTATTGGCCTAGAAGACCTATTGGCC5555ATCTTATCTTCTGG

16、ATAACCGGCTGGATAACCGG33聚合反应的特点聚合反应的特点DNA DNA 新链生成需新链生成需引物引物和和模板模板； 新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 5 3 3 方向进行方向进行 。DNA连接酶酶连接酶酶DNA聚合酶聚合酶解螺旋酶解螺旋酶单链单链DNA结合蛋白结合蛋白引物酶引物酶DNA拓扑异构酶拓扑异构酶DNA复制的酶复制的酶三、参与三、参与DNADNA复制的酶类复制的酶类理理顺顺DNA链链拓拓扑扑异异构构酶酶(gyrA, B)稳稳定定已已解解开开的的单单链链单单链链DNA结结合合蛋蛋白白SSB催催化化RNA引引物物生生成成引引物物酶酶DnaG(dnaG)运运送送和和协协同同

17、DnaBDnaC(dnaC)解解开开DNA双双链链解解螺螺旋旋酶酶DnaB(dnaB)辨辨认认起起始始点点DnaA(dnaA)蛋蛋白白质质（基基因因）通通用用名名功功能能原原核核生生物物复复制制起起始始的的相相关关蛋蛋白白质质E. Coli 基因图基因图1、解螺旋酶、解螺旋酶(helicase) 利用利用ATP供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使DNA双链双链解开成为两条单链。解开成为两条单链。解螺旋酶解螺旋酶ATPdnaA、B、CDnaA、B、C2 2、单链、单链DNADNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA (single stranded DNA binding

18、 protein, SSB)binding protein, SSB)复制中维持模板处于单链状态并保护单链完整复制中维持模板处于单链状态并保护单链完整作用作用：防止单链防止单链DNADNA重新形成双链，防止单链重新形成双链，防止单链DNADNA被核被核酸酶水解酸酶水解（1 1） 拓扑一词的含义是指物体或图象拓扑一词的含义是指物体或图象做弹性移位而又保持物体不变的性质。做弹性移位而又保持物体不变的性质。 DNA DNA 分子中存在打结，缠绕、连分子中存在打结，缠绕、连环的现象。环的现象。 3.拓扑异构酶（拓扑异构酶（DNA topoisomerase）DNADNA正超螺旋与负超螺旋正超螺旋与负超

19、螺旋负超螺旋负超螺旋正超螺旋正超螺旋DNADNA双螺旋双螺旋拓扑异构酶拓扑异构酶超螺旋超螺旋螺旋解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成（2 2）拓扑异构酶作用特点）拓扑异构酶作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶（3 3）分）分 类类 DNA拓扑异构酶动画.mov拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；解链旋转不致打结；切口的切口的3端端可通过自由转动一周再与可通过自由转动一周再与5端磷酸连接，端磷酸连接，DNA变为松弛状变为松弛状态态。反应反应不需不需ATP。（4

20、 4）作用机制）作用机制 TopoTopo酶：切割酶：切割DNADNA链，使其松弛后再连接链，使其松弛后再连接HelicaseTopo（DNA Gyrase）解螺旋酶解螺旋酶HelicaseSupercoiled DNATOPOTOPOTOPOTOPOTOPOTOPOTOPOTOPOTOPOTOPO拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNADNA分子分子两股两股链，断端通链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。过切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATPATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNADNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。Topo酶：切割DNA链，使其松弛后再连接HelicaseTopo

21、（DNA Gyrase）HelicaseSupercoiled DNATOPOTOPOTOPOTOPOTOPOTOPOTOPOTOPOTOPO ATP ATPTOPO解链酶解链酶 DNADNA拓朴异构酶拓朴异构酶 单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白 SSBSSB解开解开、理顺理顺 DNADNA链、维持链、维持DNADNA单链单链状状 特殊的特殊的RNA RNA 聚合酶聚合酶复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNARNA引物的酶引物的酶引物长短：原核生物引物长短：原核生物 50-100bp50-100bp 真核生物真核生物 10-20bp10-20bp4、引物酶、引物酶(primase)：引

22、物酶引物酶 5 5 5 5 催化催化RNARNA引物引物合成的酶叫合成的酶叫引物酶引物酶，它是一种特，它是一种特殊的殊的RNARNA聚合酶聚合酶 DNADNA合成需在合成需在RNARNA引物引物的基础上进行的基础上进行RNARNA引物引物5 5 3 3 5 5 3 3 5 5、DNA聚合酶聚合酶全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-pol活性：活性：1. 53 的聚合活性：以的聚合活性：以DNA为模板合成为模板合成DNA 2. 核酸外切酶活性：核酸外切酶活性： 53 35 DNADNA聚合酶的特点：聚合

23、酶的特点：1.1.底物是底物是dNTPdNTP。有高度亲和力。有高度亲和力。2.2.催化催化3-53-5磷酸二酯键。磷酸二酯键。3.3.不可以使两个游离的单核苷酸形成不可以使两个游离的单核苷酸形成3-3-55磷酸二酯键。磷酸二酯键。4.4.催化子链与母链之间以碱基互补的形式催化子链与母链之间以碱基互补的形式形成氢键。形成氢键。5.5.外切酶的活性。外切酶的活性。5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性切除引物

24、和突变的切除引物和突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 ？（1 1）原核生物的）原核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶可可能能不不可可能能可可能能基基因因突突变变后后的的致致死死性性无无无无有有5 3 核核酸酸外外切切酶酶活活性性20？400分分子子数数/细细胞胞多多亚亚基基不不对对称称二二聚聚体体？单单肽肽链链组组成成250120109分分子子量量(kD)DNA-polIIIDNA-polIIDNA-polI可可能能不不可可能能可可能

25、能基基因因突突变变后后的的致致死死性性无无无无有有5 3 核核酸酸外外切切酶酶活活性性20？400分分子子数数/细细胞胞多多亚亚基基不不对对称称二二聚聚体体？单单肽肽链链组组成成250120109分分子子量量(kD)DNA-polIIIDNA-polIIDNA-polI功能功能： 53 聚合酶活性、聚合酶活性、 53 和和35 外切酶活性外切酶活性 复制中的错误校读，复制和修复中的空隙填补复制中的错误校读，复制和修复中的空隙填补。DNA-pol （109kD）美国科学家美国科学家,科恩伯格科恩伯格 Kornberg 1955年从年从E.Cole 中发现了中发现了DNA 聚合酶，为聚合酶，为DN

26、A的复的复制打下了基础。为此制打下了基础。为此，Kornberg 1959年年获得诺贝尔奖。获得诺贝尔奖。Arthur Kornberg (亚瑟亚瑟.科恩伯格科恩伯格)美国生物化学家美国生物化学家美国斯坦福大学结构美国斯坦福大学结构生物学教授生物学教授20062006年，因对年，因对“真真核转录的分子基础核转录的分子基础所作的研究所作的研究”，独，独享诺贝尔化学奖。享诺贝尔化学奖。罗杰罗杰科恩伯格（科恩伯格（Roger D. Roger D. KornbergKornberg，1947-1947-）亚瑟亚瑟.科恩伯格的长子。科恩伯格的长子。323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核

27、酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶(将将DNA-pol-分成两段分成两段)DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 有关研究有关研究DNA-pol （120kD）DNA-pol IIDNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol IIDNA-pol II对模板的特异性不高，即使在已发生对模板的特异性不高，即使在已发生损

28、伤的损伤的DNADNA模板上，它也能催化核苷酸聚合，因模板上，它也能催化核苷酸聚合，因此认为此认为它可能参与它可能参与DNADNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。 功能：功能：原核生物复制延长中原核生物复制延长中真正起催化作用的酶真正起催化作用的酶 DNA-pol (250kD)多亚基、不对称、二聚体多亚基、不对称、二聚体为核心酶为核心酶： ：5 5 33 聚合活性聚合活性 ：3 3 55 外切酶活性外切酶活性 （辨别碱基）（辨别碱基） ：维系：维系二聚体作用二聚体作用：夹稳模板链并使酶沿模板滑动：夹稳模板链并使酶沿模板滑动复合物：促进全酶组装到模板上，增强核心酶的活性复合物：促进全酶

29、组装到模板上，增强核心酶的活性（2 2）常见真核生物的）常见真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶（五种）（五种）DNA-pol 起始引发，有起始引发，有引物酶引物酶活性。活性。延长子链延长子链的主要酶的主要酶，解螺旋酶活性解螺旋酶活性参与低保真性度复制参与低保真性度复制在复制过程中起在复制过程中起校读、修复和填校读、修复和填补空隙补空隙的作用（的作用（DNA-pol)。在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶填填补补引引物物空空隙隙，切切除除修修复复，重重组组延延长长子子链链的

30、的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性线线粒粒体体DNA复复制制低低保保真真度度的的复复制制起起始始引引发发，引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512.514.04.016.5分分子子量量（kD）DNA-pol填填补补引引物物空空隙隙，切切除除修修复复，重重组组延延长长子子链链的的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性线线粒粒体体DNA复复制制低低保保真真度度的的复复制制起起始始引引发发，引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512.

31、514.04.016.5分分子子量量（kD）DNA-polDNA连接酶连接酶ATPADPPOO-O-O3553目目 录录HO5POO-O-O3536 6、DNA连接酶连接酶断端的断端的3 -OH末端，末端， 5 - P末端末端连接的是双链中的单链连接的是双链中的单链缺口缺口需要需要ATP （1）DNA连接酶作用条件：连接酶作用条件：复制中起最后复制中起最后接合缺口接合缺口作用。作用。DNADNA修复、重组及剪接中起修复、重组及剪接中起缝合缺口缝合缺口作用。作用。基因工程的重要基因工程的重要工具酶工具酶之一。之一。（2）DNA连接酶连接酶功能功能第三节第三节DNADNA的复制过程的复制过程一、原

32、核生物的一、原核生物的DNADNA生物合成生物合成 1.1.复制的起始：复制的起始：需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2. 形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3 -OH末端。末端。起点起点起点复制复制倒倒Y YE.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209

33、 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 （1 1）. .DNADNA解链解链: :有固定的复制起点有固定的复制起点OriCOriC反向重复序列反向重复序列复制起始点的识别复制起始点的识别解螺旋酶解开双链解螺旋酶解开双链SSB参与维持参与维持DNA的单链结构的稳定的单链结构的稳定 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(可能主要是可能主要是II型酶型酶的作用的作用)，在将要打结或已打结处作，在将要打结或已打结处作切口。切口。3 5 3 5 引物引物3 HO5引物引物酶酶 Dna B、 Dna CDNA拓扑异

34、构酶拓扑异构酶SSB含有解螺旋酶含有解螺旋酶(Dna B) 、DnaC、引物酶和、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为复制起始区域的复合结构称为引发体引发体。 （2）引发体和引物）引发体和引物DnaADnaA引发体（引发体（primosomeprimosome）：包括解螺旋酶）：包括解螺旋酶 、DnaCDnaC、引物酶及、引物酶及DNADNA复制的起始区域复制的起始区域 5 5 3 3 3 3 5 5 引物酶引物酶DnaCDnaC引发体引发体解螺旋酶解螺旋酶3 5 3 5 引物引物3 HO5引物引物酶酶引物引物是由引物酶催化合成的短链是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。主要作用是提供

35、主要作用是提供3-OH 引物引物复制叉复制叉-DNADNA双双链解开分成两股，链解开分成两股，各自作为模板进各自作为模板进行复制，形成在行复制，形成在显微镜下可看到显微镜下可看到的叉状结构。的叉状结构。复制叉的形成复制叉的形成 Dna B、 Dna CDna A3 5 3 5 （3 3） 起始的过程起始的过程辨认并结合起始位点辨认并结合起始位点打开双螺旋打开双螺旋防止复螺旋防止复螺旋单链结合蛋白单链结合蛋白解链酶解链酶引物引物引物酶引物酶DnaA合成合成2.2.复制的延长复制的延长复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长的方式逐个加

36、入引物或延长中的子链上，其化学本质是中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键磷酸二酯键的的不断生成。不断生成。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol（1 1） 领头链的合成领头链的合成领头链：领头链：顺着解链方向生成的子链，复顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。制是连续进行的，这股链称为领头链。（2. 2.） 随从链的合成随从链的合成随从链：复制方向与解链方向相反，随从链：复制方向与解链方向相反，为不连续复制，这股不连续复制的为不连续复制，这股不连续复制的链称为随从链。链称为随从链。 复制中位于随从链

37、上的不连续复制中位于随从链上的不连续片段称为岡崎片段片段称为岡崎片段(okazaki(okazaki fragment)fragment)。岡崎片段的大小：岡崎片段的大小：真核生物：真核生物：100135bp100135bp原核生物：原核生物：10002000bp10002000bp目目 录录同一复制叉上领头连和随从链有相同的同一复制叉上领头连和随从链有相同的DNA-polDNA-pol催化延长催化延长阶段一阶段一阶段二阶段二阶段三阶段三阶段四阶段四复复制制过过程程简简图图目目 录录前导链前导链后随链后随链33553355延延 长长555555333355333355SSBSSBDNA DNA

38、 PolymerasePolymerase冈崎冈崎片断片断RNARNA引物引物引物酶引物酶553355TOPO解旋酶解旋酶 原核生物基因是原核生物基因是环状环状DNA，双向复制的复制，双向复制的复制片段在复制的片段在复制的终止点终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV40SV40病毒的基因组是一种病毒的基因组是一种环形双链的环形双链的DNA DNA 5003.3.复制的终止复制的终止原核生物原核生物DNADNA为环状，双向复制的汇合为环状，双向复制的汇合点就是复制终止点点就是复制终止点 领头链上的领头链上的RNARNA引物被引物被RNARNA酶水解

39、后，由酶水解后，由DNA polDNA pol I I 催化，由新合成链提供催化，由新合成链提供-OH-OH补齐补齐 终点终点起点起点RNARNA酶酶DNA polDNA pol I I连接酶连接酶5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-poldNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接DNA复制.mov哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNADNA合成期合成期G G1 1G G2 2S SM M 细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S S期及期及M M期这两期这两个关键点。个关键点。G1SG1S及及G2M

40、G2M的调节，与蛋白的调节，与蛋白激酶活性有关。激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。因子而实施调控作用。 二、真核生物的二、真核生物的DNADNA生物合成生物合成 多复制子多复制子 复制子复制子(replicon(replicon) )：相邻两个复制相邻两个复制起点之间的距离。复制子是独立完成复起点之间的距离。复制子是独立完成复制的功能单位。复制有时序性，即复制制的功能单位。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。子以分组方式激活而不是同步起动。 1.1.复制的起始复制的起始参与者：参与者： DNA-polDN

41、A-pol ( (引物酶活性引物酶活性) ) polpol ( (聚合酶、解螺旋酶活性聚合酶、解螺旋酶活性) ) 拓扑酶拓扑酶 复制因子复制因子 (replication factor, RF)(replication factor, RF) 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原( (proliferation cell nuclear proliferation cell nuclear antigen, PCNA) antigen, PCNA) ( (是一种蛋白质，相当于原核生物是一种蛋白质，相当于原核生物DNA-polDNA-pol 亚基，亚基，即形成闭合环形沿即形成闭合环形沿DNADNA滑动的

42、夹子，使滑动的夹子，使pol pol 获得持获得持续复制能力。续复制能力。PCNAPCNA的水平也是检验细胞增殖的重要的水平也是检验细胞增殖的重要指标指标) )目目 录录3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体2.2.复制的延长复制的延长DNA-pol DNA-pol 染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。 染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。引物，去除后留下空隙。 复制时间：真核生物：复制时间：真核生物：812h 原核生物：原核生物：20min3.3.复制的终止复制

43、的终止5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 目目 录录若干个复制子若干个复制子4.端粒端粒(telomere) 指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构分子末端的结构。 功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性 结构特点结构特点: 由末端由末端单链单链DNA序列和序列和蛋白质蛋白质构成构成。 末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含T、G碱基的短碱基的短 序列序列(精子精子9000bp，体细胞，体细胞4000bp)。TTTTGGGGTTTTGGGG 端粒就像DNA的帽子，保护DNA重要信息不

44、丢失 生命的时钟生命的时钟?端粒酶端粒酶(telomerase) 端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒端粒RNARNA由成百个由成百个6 6个核苷酸的重复序列所组成（人个核苷酸的重复序列所组成（人TTAGGGTTAGGG，四膜虫为，四膜虫为TTGGGGTTGGGG）。）。 端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 组成组成端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化

45、延长作用爬爬行行模模型型目目 录录结合长链末结合长链末端端3-OH逆转录延逆转录延长长反摺连接反摺连接DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工目目 录录（1 1）端粒酶正常体细胞活性较低，癌细胞）端粒酶正常体细胞活性较低，癌细胞的活性强。通过抑制癌细胞的端粒酶活的活性强。通过抑制癌细胞的端粒酶活性来治疗癌症。性来治疗癌症。（2 2）体外实验端粒因细胞分裂次数增加而）体外实验端粒因细胞分裂次数增加而变短到一定程度时，细胞就会死亡。变短到一定程度时，细胞就会死亡。（3 3）端粒破损会导致）端粒破损会导致DNADNA变得脆弱、容易变得脆弱、容易发生变异，可能导致一些与衰老有关的发

46、生变异，可能导致一些与衰老有关的疾病，如动脉硬化和某些癌症。疾病，如动脉硬化和某些癌症。说明：说明：逆转录合成逆转录合成DNA第四节第四节一、概念一、概念 逆转录指遗传信息从逆转录指遗传信息从RNA流向流向DNA，是，是RNA指导下的指导下的DNA合成合成过程，即以过程，即以RNA为模板，四种为模板，四种dNTP为原料，合成与为原料，合成与RNA互补的互补的DNA单链。单链。 逆转录逆转录酶酶逆转录酶的发现逆转录酶的发现美国加州理工学院的教授戴维和美国癌症学会传染性肿瘤学和美国加州理工学院的教授戴维和美国癌症学会传染性肿瘤学和细胞生物学教授侯活于细胞生物学教授侯活于19701970年在鸡肉瘤中

47、发现了逆转录酶，发年在鸡肉瘤中发现了逆转录酶，发展了中心法则。于展了中心法则。于19751975年获得诺贝尔奖。年获得诺贝尔奖。 戴维戴维.巴尔的摩巴尔的摩(David Baltimore)侯活侯活.特明特明(Howard temin)二、逆转录酶二、逆转录酶(reverse transcriptase) 催化逆转录过程的酶称逆转录酶，催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNARNA病毒病毒中含有此酶。中含有此酶。具有三种酶活性：具有三种酶活性： RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶聚合酶 RNARNA水解酶的活性水解酶的活性 DNADNA指导的指导的DNADNA聚合酶聚合酶 反转录酶没有反转

48、录酶没有3 355核酸外切酶活性，因此它无核酸外切酶活性，因此它无校对功能校对功能. . 逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂杂化双链化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAA核酸内切酶核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转

49、录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。 试管内合成试管内合成cDNAcDNA complementary DNA 反转录过程动画.mov四、四、逆转录研究的意义逆转录研究的意义 1.逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。中的重大发现。 2.在某些生物，在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与同样兼有遗传信息传代与表达功能。表达功能。3.逆转录病毒的研究，拓宽了病毒致癌理论。逆转录病毒的研究，拓宽了病毒致癌理论。4.在基因工程中获得目的基因的重要方法。在基因工程中获得目的基因的重要方法。 某些病毒的生存方式。某些

50、病毒的生存方式。 如如 HIV病毒病毒 人类免役缺陷病毒人类免役缺陷病毒胞膜蛋胞膜蛋白白衣壳蛋衣壳蛋白白RNA (病病毒基因）毒基因）双分子层双分子层1.1.病毒进入细胞病毒进入细胞2.2.病毒逆转录病毒逆转录3.3.异源重组异源重组4.4.病毒转录病毒转录5.5.翻译病毒蛋白翻译病毒蛋白后进行剪接后进行剪接6.6.组装后感染其组装后感染其他细胞他细胞治疗原理（鸡尾酒疗法）治疗原理（鸡尾酒疗法） 阻止阻止逆转录逆转录DNA 阻止阻止病毒蛋白病毒蛋白原切割原切割 红细胞血凝素攻红细胞血凝素攻击人体会牢牢抓击人体会牢牢抓住红细胞住红细胞 甲流特效药物甲流特效药物达菲达菲 （奥司他韦）口服后经肝脏和