第12章 DNA的生物合成(HDN).ppt课件.ppt

1、目录目录第三篇第三篇 基因信息的传递基因信息的传递（复制、（复制、 转录、转录、 翻译）翻译）基因基因：为生物活性产物编码的为生物活性产物编码的DNA功能片段功能片段基因基因三大特征三大特征： 携带遗传信息携带遗传信息 能被复制能被复制 能突变能突变目录目录复制复制翻译翻译 蛋白质蛋白质（病毒）（病毒） RNA（病毒）（病毒）逆转录逆转录转录转录RNA翻译翻译蛋白质蛋白质DNA复制复制中心法则（中心法则（The central dogma）目录目录第第12章章DNA的生物合成的生物合成(DNA Biosynthesis) ( Replication )目录目录复制复制(replication)

2、 是指遗传物质的传代，是指遗传物质的传代，以母链以母链DNA为模板合成子链为模板合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA复制的基本规律复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication第第 一一 节节目录目录复制的方式复制的方式 半保留复制半保留复制 (semi-conservative replication)双向复制双向复制 (bidirectional replication)半不连续复制半不连续复制 (semi-discontinuous replication) n复制的基本规律复制的基本规律 目录目录一、一、半保留复制半保留复制是是

3、DNA复制的基本特征复制的基本特征 DNA生物合成时，母链生物合成时，母链DNA解开为两股解开为两股单链，各自作为模板单链，各自作为模板(template)按碱基配对规按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制碱基序列一致。这种复制方式称为方式称为半保留复制半保留复制。n半保留复制的概念半保留复制的概念: :AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGT

4、GACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA目录目录n子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 n密度梯度实验密度梯度实验: : 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一

5、代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果目录目录按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA A的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的全部遗传信息，体现了遗传的保守性保守性。n半保留复制的意义半保留复制的意义: :遗传的保守性，是物种稳定性的分子遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但基础，但不是绝对的不是绝对的。目录目录原核生物复制时，原核生物复制时，DNA从从起始点起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为反

6、的复制叉，称为双向复制双向复制。 二、二、DNA复制从起始点向两个方向复制从起始点向两个方向延伸形成延伸形成双向复制双向复制A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C目录目录真核生物每个染色体有多个起始点，是多复真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个的距离定为一个复制子复制子(replicon) 。复制子。复制子是独立完成复制的功能单位。是独立完成复制的功能单位。

7、 53oriorioriori535533553复制复制3目录目录三、三、DNA一股子链复制的方向与解链一股子链复制的方向与解链方向相反导致方向相反导致半不连续复制半不连续复制3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 3 3 5 领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)目录目录顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为的，这股链称为领头链领头链(leading strand) 。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复不能顺着解

8、链方向连续延长，这股不连续复制的链称为制的链称为随从链随从链(lagging strand) 。复制中的不连续片段称为复制中的不连续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。复制的半不连续性。 目录目录DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化第第 二二 节节The Enzymology and Topology of DNA Replication目录目录n参与参与DNA复制的物质复制的物质:底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP

9、；(dNTP)聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合聚合酶，简写为酶，简写为 DNA-pol；模板模板(template): 解开成单链的解开成单链的DNA母链；母链；引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以可以依次聚合；依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。其他的酶和蛋白质因子。目录目录一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应是复制的基本化学反应(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi目录目录二、二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合聚合酶催化核苷酸之间聚合 全称：全称：

10、依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA- dependent DNA polymerase) 简称：简称：DNA-pol 活性：活性： 1. 53 的聚合活性的聚合活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 聚合反应的特点聚合反应的特点: : DNA 新链生成需新链生成需引物引物和和模板模板；新链的；新链的延长只可沿延长只可沿5 3 方向进行。方向进行。5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切

11、除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。n核酸外切酶活性核酸外切酶活性: : 目录目录（一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型聚合酶分为三型DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录目录原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶可可 能能不不 可可 能能可可 能能基基 因因 突突 变变 后后 的的 致致 死死 性性无无无无有有5 3 核核 酸酸 外外 切切 酶酶 活活 性性20？400分分 子子 数数 /细细 胞胞多多 亚亚 基基 不不 对对 称称二二 聚聚 体体？单单 肽肽 链链组组 成成25012010

12、9分分 子子 量量 (kD)DNA-polIIIDNA-polIIDNA-polI可可 能能不不 可可 能能可可 能能基基 因因 突突 变变 后后 的的 致致 死死 性性无无无无有有5 3 核核 酸酸 外外 切切 酶酶 活活 性性20？400分分 子子 数数 /细细 胞胞多多 亚亚 基基 不不 对对 称称二二 聚聚 体体？单单 肽肽 链链组组 成成250120109分分 子子 量量 (kD)DNA-polIIIDNA-polIIDNA-polI目录目录n功能：功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。出现的空隙进行填补。 DNA-po

13、l （109kD）目录目录323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 目录目录DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的生损伤

14、的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态损伤的应急状态修复。修复。目录目录n功能：功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶 DNA-pol (250kD)目录目录（二）常见的真核细胞（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有五种聚合酶有五种DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。

15、口的作用。在线粒体在线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录目录真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶填补引物填补引物空隙，切空隙，切除修复，除修复，重组重组延长子延长子链的主链的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性线粒体线粒体DNA 复复制制低保低保真度真度的复的复制制起始引起始引发，引发，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（ kD）DNA -pol填补引物填补引物空隙，切空隙，切除修复，除

16、修复，重组重组延长子延长子链的主链的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性线粒体线粒体DNA 复复制制低保低保真度真度的复的复制制起始引起始引发，引发，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（ kD）DNA -pol目录目录三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据功能是复制保真性的酶学依据 复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。准确传代的基本原理。 此外还需酶学的

17、机制来保证复制的保真性。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。目录目录A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。不表现活性。（一）核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配（一）核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正碱基并加以校正目录目录（二）复制的保真性依赖正确的碱基选择（二）复制的保真性依赖正确的碱基选择 DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。与共价（磷酸

18、二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。目录目录遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时复制出错时DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。nDNA复制的保真性复制的保真性 至少要依赖三种机制：至少要依赖三种机制：目录目录四、复制中的分子解链伴有四、复制中的分子解链伴有DNA 分子拓扑学变化分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有分子的碱基埋在双

19、螺旋内部，只有把把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。目录目录（一）多种酶参与（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态理理顺顺DNA链链拓拓扑扑异异构构酶酶(gyrA, B)稳稳定定已已解解开开的的单单链链单单链链DNA结结合合蛋蛋白白SSB催催化化RNA引引物物生生成成引引物物酶酶DnaG(dnaG)运运送送和和协协同同DnaBDnaC(dnaC)解解开开DNA双双链链解解螺螺旋旋酶酶DnaB(dnaB)辨辨认认起起始始点点DnaA(dnaA)蛋蛋白白质质（基基因因）通通用用名名功功能能原原核核生生物物复复制制起起始始的的相相关关蛋蛋白白质质目录目

20、录解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作供能，作用于氢键，使用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。双链解开成为两条单链。引物酶引物酶(primase) 复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物的酶。引物的酶。单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整处于单链状态并保护单链的完整。 目录目录108局部解链后局部解链后（二）（二）DNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、超螺旋状态、理顺理顺DNA链链n复制过程正超螺旋的形成：复

21、制过程正超螺旋的形成：目录目录既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键。、又能连接磷酸二酯键。 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶n拓扑异构酶分类：拓扑异构酶分类：n拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶作用特点：松懈松懈DNADNA双螺旋结构，使双螺旋结构，使DNADNA由正由正超螺旋变为负超螺旋。超螺旋变为负超螺旋。n拓扑异构酶的功能：拓扑异构酶的功能：目录目录拓扑异构酶拓扑异构酶 切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状变为松弛状态态。反应反应不需不需ATP。拓扑异构酶拓扑异构酶 切断切断DN

22、A分子分子两股两股链，断端通过切口旋链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。转使超螺旋松弛。 利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子进分子进入负超螺旋状态。入负超螺旋状态。n作用机制：作用机制：目录目录n拓扑酶的作用方式：拓扑酶的作用方式：目录目录五、五、DNA连接酶连接连接酶连接DNA双链中的双链中的单链缺口单链缺口连接连接DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5 -P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的段相邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。n DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式：作用方

23、式：POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPADP5353nDNA连接酶的作用机制：连接酶的作用机制：目录目录DNA连接酶在复制中起最后接合缺口连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。的作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。n功能：功能：目录目录DNA生物合成过程生物合成过程The Process of DNA Replication第第 三三 节节目录目录（一）复制起始：（一）复制起始：DNA解链形成引发体解链形成引发体需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. D

24、NA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2. 形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3 -OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNA生物合成生物合成目录目录E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 3 3串联重复序列串联重

25、复序列 2 2反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 1. DNA解链解链目录目录目录目录 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 2. 引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为复制起始区域的复合结构称为引发体引发体。目录目录3 5 3 5 引物引物是由引物酶催化合成的短链是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶目录目录（二）复制的延长过程：（二）复制的延长过程： 领头链连续复制，随从链不连续复制领头链连续复制，随从链不连续复制

26、复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。不断生成。 复复制制过过程程简简图图目录目录 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段，双向复制的复制片段在复制的终止点在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）复制的终止过程：（三）复制的终止过程： 切除引物、填补空缺、连接切口切除引物、填补空缺、连接切口目录目录5 5 5 RNA酶酶OHP5 DN

27、A-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶n 随从链上不连续性片段的连接：随从链上不连续性片段的连接：目录目录目录目录哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成目录目录真核生物每个染色体有多个起始点，是多复真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。制子复制。复制有时序性，即复制子以分组复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要复制的起始需要DNA-pol （引物酶活性）（引物酶活性）和和pol （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶（解螺

28、旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子和复制因子(replication factor, RF)。 （一）真核生物复制的起始与原核基本相似（一）真核生物复制的起始与原核基本相似目录目录增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA） 在复制起始和延长中起关键作用。在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶聚合酶的的亚基相同的功能和相似的构象，亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，夹子，PCNA结合于引物模板链；结合于引物模板链

29、； 并且并且PCNA使使pol获得持续合成能力。获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。水平也是检验细胞增殖的重要指标。目录目录细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S期及期及M期这两期这两个关键点。个关键点。G1S及及G2M的调节的调节，与蛋白，与蛋白激酶活性有关。激酶活性有关。蛋白激酶蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。子而实施调控作用。蛋白激酶组成：蛋白激酶组成：调节亚基调节亚基细胞周期蛋白细胞周期蛋白(cyclin)催化亚基催化亚基细胞周期蛋白依赖激酶细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin dependent k

30、inase，CDK)。 目录目录CDK相匹配的周期蛋白相匹配的周期蛋白作用点作用点CDK2Cyclin D1, D2, D3G1期期Cyclin EG1S期期Cyclin AS期期CDK3和和CDK4Cyclin D1, D2, D3G2期期CDK1（CDC2）Cyclin A, BG2M期期哺乳类动物的周期蛋白和哺乳类动物的周期蛋白和CDK目录目录 DNA-pol 和和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。性。 在复制叉及引物生成后，在复制叉及引物生成后，DNA-pol 通过通过PCNA的的协同作用，逐步取代协同作用，逐步取代pol ，在，在RNA引物的引物的3 -

31、OH基础上连续合成领头链。基础上连续合成领头链。 随从链引物也由随从链引物也由pol 催化合成。然后由催化合成。然后由PCNA协协同，同，pol 置换置换pol ，继续合成，继续合成DNA子链。子链。 （二）真核生物复制的延长（二）真核生物复制的延长 发生发生DNA聚合酶聚合酶/转换转换目录目录3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体n真核生物复制叉的延长：真核生物复制叉的延长： 目录目录染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接连接。（过程与原核生

32、物相似）。（过程与原核生物相似）染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙引物，去除后留下空隙。（染色体复制危。（染色体复制危机）机）（三）（三） 真核生物复制的终止真核生物复制的终止 5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 目录目录端粒端粒(telomere) 指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。n端粒的功能：端粒的功能：维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性维持维持DNA复制的完整性复制的完整性n端粒的结构特点：端粒的结构特点：由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成

33、。末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、C碱基碱基的短序列。的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG目录目录端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) n组成：组成：目录目录端粒酶催化作用的爬行模型端粒酶催化作用的爬行模型 目录目录逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式

34、Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways第四节第四节目录目录逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转录逆转录酶酶一、逆转录一、逆转录 逆转录病毒的基因组是逆转录病毒的基因组是RNA，其复制方式，其复制方式是逆转录是逆转录(reverse transcription) 目录目录n逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象:RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA目录目录分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，

35、作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。 n试管内合成试管内合成cDNA:cDNA complementary DNA 逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目录目录二、逆转录的发现发展了中心法则二、逆转录的发现发展了中心法则逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。究中的重大

36、发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已世纪初已注意到的病毒致癌理论。注意到的病毒致癌理论。 3 -OH5 -P5 5 5 3 3 3 3 55 5 3 3 5 三、滚环复制三、滚环复制噬菌体噬菌体DNA的复制方式的复制方式目录目录dNTPDNA-pol 四、四、D环复制环复制(D-loop replication) 是线粒体是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。的复制形式。 DNA损伤（突

37、变）与修复损伤（突变）与修复DNA Damage (Mutation) & Repair第五节第五节目录目录DNA突变突变(Mutation)具体指个别具体指个别dNMP残基以至片段残基以至片段DNA在在构成、复制或表型功能的异常变化，也称构成、复制或表型功能的异常变化，也称为为DNA损伤损伤(DNA damage)。从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNA分子上分子上碱基的改变。碱基的改变。 目录目录一、突变在生物界普遍存在一、突变在生物界普遍存在（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础（二）只有基因型改变的突变形成（二）只有基因型改变的突变形成DNA的

38、多态性的多态性 (polymorphism)（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡（四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础目录目录二、多种化学或物理因素可诱发突变二、多种化学或物理因素可诱发突变大量的突变属于自发突变，发生频率只不过在大量的突变属于自发突变，发生频率只不过在10-9左右。但由于生物基因组庞大，细胞繁殖速度快，左右。但由于生物基因组庞大，细胞繁殖速度快，因此它的作用是不可低估的。因此它的作用是不可低估的。实验室用来诱发突变，也是生活环境中导致突变实验室用来诱发突变，也是生活环境中导致突变的因素，主要有物理和化学因素。的

39、因素，主要有物理和化学因素。 目录目录n物理因素：物理因素：紫外线紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射、各种辐射 UV二、多种化学或物理因素可诱发突变二、多种化学或物理因素可诱发突变n化学因素：化学因素：常常见见的的化化学学诱诱变变剂剂化化合合物物类类别别作作用用点点分分子子改改变变碱碱基基类类似似物物如如：5-BUA 5-BU G-A -T -G -C -羟羟胺胺类类（NH2OH）T C-T -A -C -G -亚亚硝硝酸酸盐盐（NO2）C U-G -C -A -T -烷烷化化剂剂如如：氮氮芥芥类类，NitrominsG mGG mGDNA缺缺失失G目录目录三、引起突变的分子

40、改变类型有多种三、引起突变的分子改变类型有多种错配错配 (mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement) 框移框移(frame-shift) 目录目录DNA分子上的碱基错配称分子上的碱基错配称点突变点突变 (point mutation)。自发突变和不少化学诱变都能引起自发突变和不少化学诱变都能引起DNA上某上某一碱基的置换。一碱基的置换。点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸改变。改变。 （一）错配可导致编码氨基酸的改变（一）错配可导致编码氨基酸的改变目录目录镰形红细胞贫血病人镰形

41、红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA)亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因n镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb 亚基点突变亚基点突变目录目录（二）缺失、插入和框移突变（二）缺失、插入和框移突变 造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分大分子上消失。子上消失。插入：插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链原来

42、没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到插入到DNA大分子中间。大分子中间。缺失或插入都可导致缺失或插入都可导致框移突变框移突变 。框移突变框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 目录目录谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失Cn缺失引起框移突变：缺失引起框移突变：目录目录（三）重组或重排常（三）重组或重排常 可引起遗传、肿瘤等疾病可引起遗传、肿瘤等疾病DNA分子内较大片段的交换，称

43、为重组或分子内较大片段的交换，称为重组或重排。重排。移位的移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。重组。 目录目录DNA损伤（突变）可能造成两种结果：损伤（突变）可能造成两种结果：其一其一是导致复制或转录障碍（如胸腺嘧是导致复制或转录障碍（如胸腺嘧啶二聚体，啶二聚体，DNA骨架中产生切口或断裂）；骨架中产生切口或断裂）；其二其二是导致复制后基因突变（如胞嘧啶是导致复制后基因突变（如胞嘧啶自发脱氨基转变为尿嘧啶），使自发脱氨基转变为尿嘧啶），使DNA 序列发序列发生永久性改变。生永久性改变。 所

44、以，必须通过进化使细胞拥有灵敏的所以，必须通过进化使细胞拥有灵敏的机制，以识别和修复这些损伤，否则细胞无机制，以识别和修复这些损伤，否则细胞无法维持正常代谢。法维持正常代谢。目录目录四、四、DNA损伤的修复损伤的修复修复修复(repairing)是对已发生分子改变的补是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。偿措施，使其回复为原有的天然状态。 光修复光修复(light repairing) 切除修复切除修复(excision repairing) 重组修复重组修复(recombination repairing) SOS修复修复 n修复的主要类型：修复的主要类型：目录目录（一）直

45、接修复系统利用酶简单地逆转（一）直接修复系统利用酶简单地逆转DNA损伤损伤光修复酶光修复酶(photolyase) UV目录目录（二）核苷酸切除修复系统识别（二）核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形双螺旋变形 这是细胞内最重要和有效的修复方式。这是细胞内最重要和有效的修复方式。 其过程包括去除损伤的其过程包括去除损伤的DNA，填补空隙和，填补空隙和连接。连接。 主要由主要由DNA-pol和连接酶完成。和连接酶完成。 还需要多种还需要多种Uvr(ultra-voilet resistant)参与参与UvrA、UvrB、UvrC等等UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHPDNA连接

46、酶连接酶ATPnE.coli的切的切除修复机制除修复机制目录目录目录目录（三）重组修复（三）重组修复亦称复制后修复亦称复制后修复RecADNA pol（三）重组修复（三）重组修复 亦称复制后修复，结果是保留亦称复制后修复，结果是保留了损伤并遗传给下次复制，但可被不断稀释。了损伤并遗传给下次复制，但可被不断稀释。目录目录（四）（四）SOS修复修复当当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。一系列复杂的反应。在在E. coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子调节子(regulon)的网络式调控系统。的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。（由（由DNA-pol 进行进行低保真度的复制低保真度的复制 ）通过通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。变。