微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇课件.ppt
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1、微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇二二.微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线三三.提高内生菌紫杉醇的产量的方法提高内生菌紫杉醇的产量的方法一、紫杉醇的概况和作用机制一、紫杉醇的概况和作用机制红豆杉树红豆杉树一、紫杉醇的概况和作用机制一、紫杉醇的概况和作用机制紫杉醇紫杉醇(Paclitaxel,Paclitaxel,商品名商品名TaxolTaxol)的概述:的概述: 1963年美国化学家瓦尼(M.C. Wani)和沃尔(Monre E. Wall)首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉(Pacific Yew)树皮和木材中分离到了紫杉醇
2、的粗提物。 1971年Wall 和Wani将粗提物进行纯化,并确定了其化学结构(一种四环二萜化合物,并把它命名为紫杉醇(taxol)。 2001 年Huang Q 等通过实验获得紫杉醇生物合成的重要中间产物紫杉二烯( Taxadiene, 产量达13mg/L) , 成为基因工程菌合成紫杉醇中间体的先例。 紫杉醇发现到临床应用大约经历了30 年的时间。注:紫杉醇是一种复杂的具有抗癌活性的三环二萜类生物碱。二二 微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线 实验材料 罗汉松的树皮 实验方法1 1 内生真菌分离内生真菌分离2 2 内生真菌纯化、鉴定与保存内生真菌纯化、鉴定与保存3
3、 3 发酵培养发酵培养4 4 发酵产物的处理发酵产物的处理(紫杉醇的提取、纯化、含量测定)(紫杉醇的提取、纯化、含量测定)1 内生真菌分离 1)对植物组织表面进行消毒, 以控制表生真菌的生长, 使内生真菌得以分离。其分离方法是先用水冲洗已剪碎的植物材料, 然后在75%乙醇中浸泡3min 后,最后用无菌水冲洗。 2)分离所用的培养基为PDA 培养基。为了防止细菌污染可在培养基中加抗菌素, 如链霉素、四环素等。温箱中28 培养3-4 d 后观察. 在分离内生真菌时常添加一些宿主植物的提取液,以满足内生真菌的一些特殊的营养需求2 内生真菌纯化、鉴定与保存待培养基上初步长出菌落后,选择长势较好的菌落,
4、挑取菌丝到PDA平板上纯化,根据经典形态学方法鉴定菌种。纯化的菌株在PDA斜面4下保持,备用。3 发酵培养 从PDA 平板上切取5 mm 5 mm 小块菌落,接种至装有150 mL 液体培养基的500 mL 三角瓶中, 于28 , 100 r/ min 摇床上振荡培养10-14 d.4 发酵产物的处理发酵产物的处理 1)紫杉醇的提取)紫杉醇的提取 常用的有机溶剂:甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等 提取原则:能够充分萃取出发酵液和菌丝中的紫杉醇 具体方法: 发酵液过滤后, 菌丝研磨(加适量石英砂),滤液称量体积。 滤渣烘干( 低于50) ,滤渣用适量乙酸乙酯萃取, 滤液用1/2 滤液体积的
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