高效液相色谱分析课件.ppt

1、16:44:38第第第第第第三三三三三三章章章章章章 高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱分析分析分析分析分析分析一、一、PHCE基本原理基本原理basic principles of PHCE二、电渗现象与电渗流二、电渗现象与电渗流electroosmosis and electroosmotic flow三、影响电渗流的因素三、影响电渗流的因素factors influenced electroosmosis四、淌度四、淌度mobility五、五、PHCE中的参数与关系中的参数与关系式式parameters and relation in HPCE六、影

2、响分离效率的因素六、影响分离效率的因素factors influenced separation efficiency第八节第八节第八节第八节第八节第八节高效毛细管电泳理论高效毛细管电泳理论高效毛细管电泳理论高效毛细管电泳理论高效毛细管电泳理论高效毛细管电泳理论基础基础基础基础基础基础high performance liquid chromatograph,HPLCbasic theory of HPCE16:44:38 一、高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳( ( ( ( ( (HPCE)HPCE)HPCE)HPCE)H

3、PCE)HPCE)基本原理基本原理基本原理基本原理基本原理基本原理 basic principles of PHCEbasic principles of PHCEbasic principles of PHCE 电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？迁移速度与哪些因素有关？ 当带电离子以速度当带电离子以速度 在电场中移动时，受到大小相等、在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：电场力：FE = qE

4、 阻阻 力：力：F = f故：故： qE = fq离子所带的有效电荷；E 电场强度；离子在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数 ( 对于球形离子： f =6； 离子的表观液态动力学半径； 介质的粘度； )16:44:39所以，迁移速度：所以，迁移速度：EqfqE 6 （球形离子） 物质离子在电场中物质离子在电场中差速迁移差速迁移是电泳分离的基础。是电泳分离的基础。淌度淌度 ：单位电场强度下的平均电泳速度。：单位电场强度下的平均电泳速度。 6qE 16:44:39二、电渗现象与电渗流二、电渗现象与电渗流二、电渗现象与电渗流二、电渗现象与电渗流二、电渗现象与电渗流二、电渗现象与电渗流 electro

5、osmosis and electroosmotic flowelectroosmosis and electroosmotic flowelectroosmosis and electroosmotic flow1.1.电渗流现象电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层双电层，二者之间存在电位差。 当液体两端施加电压时，当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫表面的移动的现象叫电渗现象电渗现象。 电渗现象中

6、整体移动着的电渗现象中整体移动着的液体叫液体叫电渗流电渗流（electroosmotic flow ，简称简称EOF）。）。 16:44:392.2.2.2.2.2.HPCEHPCEHPCE中的电渗现象与电渗流中的电渗现象与电渗流中的电渗现象与电渗流中的电渗现象与电渗流中的电渗现象与电渗流中的电渗现象与电渗流 石英毛细管柱，内充液石英毛细管柱，内充液pH3pH3时，表面电离成时，表面电离成- -SiOSiO- -, ,管管内壁带负电荷，形成双电层。内壁带负电荷，形成双电层。 在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实

7、际上是溶剂化的，故将引起柱中极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度的溶液整体向负极移动，速度电渗流电渗流。16:44:393.3.3.3.3.3.HPCEHPCEHPCE中电渗流的大小与方向中电渗流的大小与方向中电渗流的大小与方向中电渗流的大小与方向中电渗流的大小与方向中电渗流的大小与方向 电渗流的大小用电渗流速度电渗流的大小用电渗流速度电渗流电渗流表示，取决于电渗淌表示，取决于电渗淌度度和电场强度和电场强度E E。即即 电渗流电渗流 = = E E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的电渗淌度取决于电泳介质及双电层的ZetaZeta电势，即电势，即 = =

8、0 00真空介电常数；介电常数；毛细管壁的Zeta电势。 电渗流电渗流 = = 0 0 E E实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 电渗流电渗流 = = L Lefef/t/teoeoLef 毛细管有效长度； teo电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。16:44:39HPCEHPCEHPCE中电渗流的方向中电渗流的方向中电渗流的方向中电渗流的方向中电渗流的方向中电渗流的方向 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带负电荷，溶液带正电荷，

9、电渗流流向阴极； 内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：改变电渗流方向的方法： （1 1）毛细管改性）毛细管改性 表面键合阳离子基团； （2 2）加电渗流反转剂）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。16:44:394. 4. 4. 4. 4. 4. HPCEHPCEHPCE中电渗流的流形中电渗流的流形中电渗流的流形中电渗流的流形中电渗流的流形中电渗流的流形 电荷均

10、匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）； 液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。16:44:395. 5. 5. 5. 5. 5. HPCEHPCEHPCE中电渗流的作用中电渗流的作用中电渗流的作用中电渗流的作用中电渗流的作用中电渗流的作用 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5 57 7倍；倍； 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： + + = =电渗流电渗流 + + +ef +ef 阳离子运动方向与电渗流阳离子运动方向与电

11、渗流一致一致； - - = =电渗流电渗流 - - -ef -ef 阴离子运动方向与电渗流阴离子运动方向与电渗流相反相反； 0 0 = =电渗流电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；中性粒子运动方向与电渗流一致；（1 1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2 2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变如同改变LCLC中的流速；中的流速；（3 3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在在HPCEHPCE中，控制电渗流非常重要中，控制电渗流非常重要

12、。16:44:39三、三、三、三、三、三、HPCEHPCEHPCE中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素 factors influenced electroosmosisfactors influenced electroosmosisfactors influenced electroosmosis1.1.电场强度的影响电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。2.2.毛细管材料的影响毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；16:44:40

13、3. 3. 3. 3. 3. 3. 电解质溶液性质的影响电解质溶液性质的影响电解质溶液性质的影响电解质溶液性质的影响电解质溶液性质的影响电解质溶液性质的影响（1 1）溶液）溶液pHpH的影响的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7pH=7，达到最大达到最大； pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2 2）阴离子的影响）阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。 缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影

14、响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。16:44:4016:44:404. 4. 4. 4. 4. 4. 温度的影响温度的影响温度的影响温度的影响温度的影响温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于温度变化来自于“焦耳热焦耳热”； 焦耳热：焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量； HPCEHPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。强度成正比。 温度每变化温度每变化1 1，将引起背景电解质溶液黏

15、度变化，将引起背景电解质溶液黏度变化2%2%3%3%；16:44:405. 5. 5. 5. 5. 5. 添加剂的影响添加剂的影响添加剂的影响添加剂的影响添加剂的影响添加剂的影响（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向； 加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。 加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。16:44:40四、淌度四、淌度四、淌度四、淌度四、淌度四、淌度 mobilitymobil

16、itymobilitymobilitymobilitymobility 淌度淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；带电离子在单位电场下的迁移速度； 淌度不同是电泳分离的基础。淌度不同是电泳分离的基础。1.1.绝对淌度绝对淌度( (absolute mobility)ab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.2.有效淌度有效淌度(effective mobility)ef 实际溶液中的淌度(实验中测定的)。 efef=a ai ii i ai 溶质i 的解离度；i 溶质i 在解离状态下的绝对淌度3.3.表观淌度表观淌度 ap 离子在实际分离过程中的

17、迁移速度（表观迁移速度）： apap= =ap ap E E16:44:40五、五、五、五、五、五、HPCEHPCEHPCE中的参数与关系式中的参数与关系式中的参数与关系式中的参数与关系式中的参数与关系式中的参数与关系式 parameters and relation in HPCEparameters and relation in HPCEparameters and relation in HPCE1.1.迁移时间（保留时间）迁移时间（保留时间） HPCEHPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。理论也适用。VLLELLt

18、apefapefapef V外加电压；L毛细管总长度；2.2.分离效率（塔板数）分离效率（塔板数） 在在HPCEHPCE中，仅存在纵向扩散，中，仅存在纵向扩散，2 2=2=2DtDt22/154. 5;22 YtnDELDLVLnRefapefap 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。物大分子的依据。16:44:403.3.3.3.3.3.分离度分离度分离度分离度分离度分离度 DLVLRefap 平均平均 177. 0 影响分离度的主要因素；工作电压影响分离度的主要因素；工作电压V V；毛细管有效长度毛细管有效长度与总

19、长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：221apap 平均平均1212)(2WWttR16:44:40六、影响分离效率的因素六、影响分离效率的因素六、影响分离效率的因素六、影响分离效率的因素六、影响分离效率的因素六、影响分离效率的因素区带展宽区带展宽区带展宽区带展宽区带展宽区带展宽 factors influenced the efficiencyband broadeningfactors influenced the efficiencyband broadeningfactors influenced the effici

20、encyband broadening 1.1.纵向扩散的影响纵向扩散的影响 在在HPCEHPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：中，纵向扩散引起的峰展宽：2 2=2=2DtDt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.2.进样的影响进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度： Winj= (24D t )1/

21、2实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%1%2%2%。16:44:403.3.3.3.3.3.焦耳热与温度梯度的影响焦耳热与温度梯度的影响焦耳热与温度梯度的影响焦耳热与温度梯度的影响焦耳热与温度梯度的影响焦耳热与温度梯度的影响 电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：22EcLrIVQbm m电解质溶液的摩尔电导；I工作电流：cm电解质浓度； 散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。破坏了塞流，导致区带展宽。 改善方法：改善方法

22、： （1 1）减小毛细管内径；）减小毛细管内径； （2 2）控制散热；）控制散热；16:44:404.4.4.4.4.4.溶质与管壁间的相互作用溶质与管壁间的相互作用溶质与管壁间的相互作用溶质与管壁间的相互作用溶质与管壁间的相互作用溶质与管壁间的相互作用 存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽； 蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题难题。 细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。 减小吸附的方法和途径减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带

23、负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。16:44:405.5.5.5.5.5.其他影响因素其他影响因素其他影响因素其他影响因素其他影响因素其他影响因素 （1 1）电分散作用对谱带展宽的影响）电分散作用对谱带展宽的影响 当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2 2）“层流层流”现象对谱带展宽的影响现象对谱带展宽的影响 一般情况下，HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流； 产生的原因产生的原因：毛细管两端液面高度不同。 实

24、际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。16:44:40请选择内容请选择内容请选择内容请选择内容请选择内容请选择内容第一节第一节 概述概述generalization第二节第二节 高效毛细管电泳的理论基础高效毛细管电泳的理论基础basic theory of HPCE第三节第三节 高效毛细管电泳仪器高效毛细管电泳仪器high performance capillary electrophoresis apparatus第四节第四节 高效毛细管电泳的分离模式高效毛细管电泳的分离模式separate types of HPCE第五节第五节 应用与进展应用与进展application and advances of HPCE结束结束结束结束结束结束