人胰岛素的制备-生物技术制药课件.ppt
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- 胰岛素 制备 生物技术 制药 课件
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1、反转录反转录-聚合酶链反应法聚合酶链反应法(一一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA1, 细胞总细胞总RNA的提取的提取 :取胰岛B细胞,用PBS洗后,加入TRIZOL试将细胞破裂,后用DEPC处理,多次离心后,取RNA白色沉淀,测OD值,电泳。2 ,从总,从总RNA中分离中分离mRNA:取上述提取的总RNA若干,加入Buffer OBB ,Oligotex Suspension ,打匀。 70水浴(裂解RNA的二级结构), 20-30条件下,静置(让Oligotex与mRNA结合)。 将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心
2、,加Buffer将其他RNA洗脱,最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。(二)mRNA转录合成cDNA第一链cDNA 第一链的合成第一链的合成 加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中,加入RNase-free water,混匀后,70反应10分钟,反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、 RNA酶抑制剂、反转录酶、 dNTP(加入放射性同位素利于检验), 混匀,稍微离心反应物之后,42放置2分钟。取出置于冰上。电泳分析,同位素活性测定。 (三)(三)PCR法扩增,特异合成目的法扩增,特异合成目的cDNA链链通过胰岛素的特异引物,用PCR法进行扩增,特异的合成胰
3、岛素的cDNA链 ,获得目的基因(通过凝胶电泳回收测序后方可使用)。前端引物:前端引物:5-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3后端引物:后端引物:5-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3PCRPCR法的操作步骤:法的操作步骤:预变性 引物退火 引物延伸 循环25-35次最后延伸采用采用pBR322pBR322作为载体,用双酶切法进行基因
4、重组。作为载体,用双酶切法进行基因重组。一一 、 pBR322简介简介F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。其作为载体的优点为:双抗菌素抗性选择标记双抗菌素抗性选择标记 插入失活,分两次先后选择:没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡 分子小,克隆能力大分子小,克隆能力大载体越小越好。载体越小越好。 10kb的的DNA在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。 高
5、拷贝数高拷贝数氯霉素扩增之后,每个细胞可达氯霉素扩增之后,每个细胞可达10003000copy 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob(mobilization),不能通过接合转移。不能通过接合转移。.双酶切法双酶切法用两种酶限制性内切核酸酸消化载体用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNADNA和外源和外源DNADNA片段,使载体和外源目的基片段,使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端,将它们混合,在连接酶的作用下相同的黏性末端因的两端分别形成不同黏性末端,将它们混合,在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组可退火连接成重组DNADNA分子,从而实现分子,从而实现DNA
6、DNA的定向连接。的定向连接。.重组过程重组过程pBR322pBR322用用Hind Hind 和和BamHBamH酶切,琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。酶切,琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源外源DNADNA片段同样也用片段同样也用Hind Hind 和和BamHBamH酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外源外源DNADNA片段混合退火,因为片段混合退火,因为Hind Hind 和和BamHBamH的黏性末端不匹配,避免了载体和外的黏性末端不匹配,避免了载体和外源源DNADNA片段的自身连接,外源片段的自身连接,外源DNADNA片段只能
7、定向地连接到载体的片段只能定向地连接到载体的Hind Hind 和和BamHBamH位位点之间。当然也不可避免发生载体的点之间。当然也不可避免发生载体的Hind Hind 和和BamHBamH的黏性末端之间的两个碱基的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环,转到大肠杆菌中被修复,但这样的重组子占少数,是低效转化。互补形成开环,转到大肠杆菌中被修复,但这样的重组子占少数,是低效转化。A链和链和B链同时表达法链同时表达法(一)重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组DNA的转化1, CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞:法制备大肠杆菌感受态细胞:取100 ml 菌体培养至
8、OD600 = 0.5,离心收集菌体,用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体,离心,收集菌体,用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 ,冰浴放置12 - 24小时,备用。2,大肠杆菌感受态细胞的质粒转化:,大肠杆菌感受态细胞的质粒转化:取100 ml 感受态细胞,加入相当于50 ng 载体的重组,DNA连接液,混匀。冰浴放置半小时 。在42 保温 2 分钟(热脉冲),快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 2 分钟 。加入1 ml 新鲜培养基,于37 培养 1 小时(扩增) 。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。经典的经典的CaCl2转化方法转化方法(二)重组子的筛选和
9、鉴定(载体遗传标记检测)基本操作:基本操作:先将转化液涂布含有Ap的平板,再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上,在Ap平板上生长,但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子。抗药性筛选法:抗药性筛选法:抗药性筛选法的基本原理抗药性筛选法的基本原理:将外源DNA片段插在EcoRI位点:非重组子呈 Apr、Tcr重组子呈 Apr、Tcr 将外源DNA片段插在BamHI位点:非重组子呈 Apr、Tcr重组子呈 Apr、Tcs 再经l琼脂糖凝胶电泳,限制性图普,PCR检测DNA测序以及SDS-PAGE等分析,检测并证实了整个重组体的构建和表达筛选过程采用比浊法测定不同时间培养基中菌量,绘
10、制基因工程菌的生长曲线,在摇瓶培养的水平下,采用优化的发酵培养基发酵基因工菌,培养4小时候即进入对数生长期,而且对数生长期可延长至17小时。1,正交优化实验:,正交优化实验:采用正交法,选取摇瓶培养条件中七个主要因素进行两水平正交优化,该七个因素为:种子活化方式,摇床转速(通风量),IPTG诱导温度,接种量,IPTG添加量,诱导时间,补料方式。分别用A、B、C、D、E、F、G表示以每升培养基收获湿菌体的量及发酵液的A600为目标量,考察条件优化的效果,进行八次实验,对实验结果进行分析,优化出最佳实验条件。2,其他条件优化:,其他条件优化:在优化发酵条件的基础上,进一步就各种金属元素对苗体生长发
11、重组蛋白诱导的影响作了分析。3,放大培养(比较不同发酵工艺产量):,放大培养(比较不同发酵工艺产量):在优化摇瓶水平发酵试验的基础上,放大至1 L培养基中比较两种发酵工艺。在不同转速,通气量,pH条件下,比较选择产量最高的发酵工艺。优化发酵条件优化发酵条件由于基因工程药物是从转化细胞、而不是由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的,所以对产品的纯度要从正常细胞生产的,所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。求也要高于传统产品。基因工程药物的分离纯化一般不应超过基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤,包括细胞破碎、固液分离、浓缩个步骤,包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高
12、度纯化直至得到纯品以及与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。成品加工。发酵液发酵液细胞分离细胞分离胞内产物胞内产物细胞破碎细胞破碎固液分离固液分离包含体包含体细胞碎片分离细胞碎片分离变变 性性复复 性性透析浓缩透析浓缩再复性及酶转化再复性及酶转化高度纯化高度纯化制制 剂剂高速离心高速离心溶菌酶超声破碎细胞溶菌酶超声破碎细胞变性剂&离子型去污剂洗涤二次复性法复性变性剂(尿素)变性胞外产物胞外产物二次复性法二次复性法:05g包涵体溶解于一定量的缓冲液B(50mmolLGlyNaOH,8 molL尿素,B_巯基乙醇,pH 95)中,使之充分混悬,静置1小时以上。混悬液分步逐滴加入到缓冲液C(
13、50mmolLGly-NaOH,半胱氨酸一胱氨酸,pH 95)中,4静置复性过夜。上样于已用50mmolLGlyNaOH(pH 95)平衡的DEAE-Sepharose FF柱,用01molL的氯化钠梯度洗脱,通过SDS-PAGE确定RRhPI位置,用DEAE-Sepharose FF做离子交换层析,收集含RRhPI的洗脱峰2,层析图谱见(图6)。电泳检测显示(图11)峰2主要为RRhPI,及少量高分子杂质,收集峰2做再复性。峰1为pH高于95及一些疏水性蛋白质形成的穿透峰,绝大部分pH低于RRhPI的蛋白质和核酸类杂质则牢固地结合在柱子上,在较高盐浓度及2molL NaCl的条件下被洗脱下来
14、,形成其他峰3和峰4。胰岛素原(胰岛素原(RRhPIRRhPI)的再复性及酶切转化:)的再复性及酶切转化:1,复性将初步复性及纯化后的RRhPI通过透析浓缩,先后转换到缓冲液B和D(50mmolL G1y-NaOH,氧化型谷胱甘肽(GSSG)一还原型谷胱甘(GSH)pH95)中,使蛋白浓度为01O6 mgml,4静置过夜。2,酶切复性后的RRhPI复性液调节pH后加入一定量的胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptidase B)在37。C进行协同酶切一段时间,然后滴加2 molL ZnCI:至ZnCl:浓度为01molL终止反应并沉淀生成的hI,用双蒸水洗涤沉淀得较纯B9
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