色谱分析法概论课件.ppt
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- 色谱 分析 概论 课件
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1、色谱法是一种重要的分离、分析技术 混合试样分离单组分 检测定性、定量分析色谱法的由来色谱法的创始人俄国植物学家茨维特(M.Tswett)色谱法的由来在茨维特的实中:装有CaCO3的玻璃管 色谱柱 CaCO3 固定相 纯石油醚 流动相 色谱法的由来 在该实验中,碳酸钙在该实验中,碳酸钙上混合色素被分成不同色上混合色素被分成不同色带的现象,像一束光线通带的现象,像一束光线通过棱镜时被分成不同色带过棱镜时被分成不同色带的光谱现象一样,因此茨的光谱现象一样,因此茨维特把这种现象称为维特把这种现象称为色谱色谱,相应的分离方法称为相应的分离方法称为色谱色谱法法(色层法,层析法)(色层法,层析法) 高分离效
2、能、高灵敏度、高选择性、分析速度快、应用范围广色谱法的特点:色谱学的重要作用 诺贝尔化学奖:诺贝尔化学奖:1948年,瑞典提塞留斯年,瑞典提塞留斯 (Tiselius),电电 泳和吸附分析;泳和吸附分析;1952年,英国马丁年,英国马丁 (Martin)和辛格和辛格(Synge),分配色谱。,分配色谱。 应用的科学领域:生命科学、材料科学、环应用的科学领域:生命科学、材料科学、环 境科境科学等。(科学的科学)学等。(科学的科学) 药学(药物分析):各国药典收载了许多色药学(药物分析):各国药典收载了许多色 谱分谱分析方法。中国药典二部,析方法。中国药典二部,700多,纯多,纯度检查、度检查、定
3、性鉴别或含量测定,一部,定性鉴别或含量测定,一部,600多鉴别或含多鉴别或含量测定。量测定。 中药复方制剂质量测检和中药配伍中的应用中药复方制剂质量测检和中药配伍中的应用 色谱法实质是分离色谱分离的基本条件: 1.互不相溶的两相(流动相、固定相); 2.被分离组分在两相之间作相对运动 色谱法实质分离 分离依据: 各组分在两相之间作用力不同(吸附能力分配系数离子交换能力大小排阻能力其他亲合作用) 各组分差速异行分离色谱法分类 按两相状态分 色谱法气相色谱(GC)气固色谱(GSC)气液色谱(GLC)液固色谱(LSC) 液液色谱(LLC)液相色谱(LC)色谱法分类 按分离过程机制分 吸附色谱法吸附色
4、谱法利用吸附剂表面对不同利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差异组分物理吸附性能的差异分配色谱法分配色谱法组分在两相中分配系数组分在两相中分配系数不同不同 离子交换色谱法离子交换色谱法利用离子交换原理利用离子交换原理 排阻色谱法排阻色谱法利用多孔性物质对不利用多孔性物质对不同大小分子的排阻作用同大小分子的排阻作用 等等等等色谱法分类 按固定相的固定形式分色 谱 法柱 色 谱纸 色 谱薄 层 色 谱( 平 板 色 谱 )色谱法分类 附:根据所使用的技术不同分 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC) 化学键合相色谱化学键合相色谱 衍生气相衍生气相(液相液相)色谱色谱 裂解色谱裂解色谱 顶空气相色谱
5、顶空气相色谱 色谱制备色谱制备 色谱分析色谱分析 第二节 色谱过程 一、色谱过程实现色谱操作的基本条件是必须具备相对实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相,固定相运动的两相,固定相(stationary phase)(stationary phase)和流和流动相动相(mobile phase)(mobile phase)。色谱过程是组分的分子在流动相和固定相色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间间多次多次“分配分配”的过程。的过程。色谱过程 组分的结构和性质微小差异组分的结构和性质微小差异 与固定与固定相作用差异相作用差异 随流动相移动的速度不随流动相移动的速度不等等 差速迁移差速迁
6、移 色谱分离。色谱分离。1. 气相色谱分离过程 当试样由载气携带进入色当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时,被固定谱柱与固定相接触时,被固定相溶解或吸附相溶解或吸附; ; 随着载气的不断通入,被随着载气的不断通入,被溶解或吸附的组分又从固定相溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附中挥发或脱附; ; 挥发或脱附下的组分随着挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附相溶解或吸附; ; 随着载气的流动,溶解、随着载气的流动,溶解、挥发,或吸附、脱附的过程反挥发,或吸附、脱附的过程反复地进行。复地进行。 当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触当试样由载气
7、携带进入色谱柱与固定相接触时,被固定相溶解或吸附时,被固定相溶解或吸附; ; 随着载气的不断通入,被溶解或吸附的组分又从固随着载气的不断通入,被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附定相中挥发或脱附; ; 色谱图 被分析试样从进样开始,经 色谱柱分离,到各组分全部流过检测器 在此期间所记录下来的响应信号随时间而变化的曲线(分布的图像),称为色谱流出曲线或色谱图。色谱图及常用术语色谱峰 在一定色谱条件下,组分通过检测器时,响应信号随时间而变化的曲线称为色谱峰。 色谱过程按近理想条件和分配系数恒定时的流出曲线为对称的高斯分布曲线,对应的高斯分布函数为:222exp2)(RitttAh色谱图及常用术
8、语 基线 在色谱操作条件下仅有流动相通过检测器时,反映检测器噪声随时间变化的曲线。 稳定的基线是一条直线。 峰高 从色谱峰顶点到基线的距离ABh 区域宽度 1.峰底宽度 在色谱峰两边的转折点(也叫拐点即E F)所画的切线与基线相交的截距。两个拐点E和F之间的距离为 EF= ,分别位于 处。h607.0wb2区域宽度2.半峰宽 峰高一半处的宽度GHw21354. 221w3.标准偏差 两个拐点E和F之间的距离的 一半 4.峰面积 A 色谱峰与基线延长线所包围的面积,精确计算时 whA21065. 1 保留值的定义1.保留时间 从进样开始到色谱峰最大值出现时所需的时间tR 保留值的定义2.死时间
9、不被固定相保留的组分,从进样开始到色谱峰最大值出现时所需的时间 。(空气、甲烷或乙醚峰的保留时间)。 实际上为流动相流经色谱柱所需要的时间:tMuLtM柱长(cm)流动相平均 线速度(cm/s)保留值的定义3.调整保留时间 组分的保留时间与死时间之差tttMRRtR 色谱保留值 表明色谱峰在色谱图中的位置(可用时间t、体积V、距离d表示)。它是由色谱分离过程中的热力学因素所决定的。色谱常用术语保留值的定义 4.保留体积 从进样开始到色谱峰最大值出现时所需通过的流动相的体积 5.死体积 6.调整保留体积VRVMVVtFVMRRcRtFVRcRFc在LC中为实测值(mL/min)在GC中为校正到柱
10、稳住压下的平均流速 相对保留值 某一组分与基准物质的调整保留值之比:KKVVttrsisisiisttttMMisRRsi 总分离效能指标 分离度分离度(resolution;R):又称分辨率。是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。21RR21RR)(22/ )(1212WWttWWttR 设正常峰,W1W2= 4 , 则R=1.5时,99.7%面积(tR 3)被分开, tR =6 ,称 6 分离 。R1, 峰重叠,未分开峰重叠,未分开R = 1, 认为基本分开,认为基本分开,4分分离离R = 1.5, 两峰完全分离,两峰完全分离,6分分离离 三、分配系数与色谱分离(一) 分配系数
11、和容量因子 分配系数 (distribution coefficient;K)是在一定温度和压力下,达到分配平衡时,组分在固定相 (s) 与流动相 (m) 中的浓度 (C) 之比。ms=CCK分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度(和压力)有关。是组分的特征常数。 容量因子(capacity factor;k):在一定温度和压力下,达到分配平衡时,组分在固定相和流动相中的质量(m)之比。(摩尔数?) 又称为质量分配系数或分配比。分配系数与色谱分离msmmk 还与固定相和流动相的体积有关。mmssVCVCmsVVK容量因子与分配系数的关系tR=t0(1+ k) tR=t0(1+K ) 分配
12、系数与色谱分离(二)分配系数和容量因子与保留时间的关系uvR v=L/tRu=L/t0RttR0ssmmmmSmmsmmVCVCVCNNNtttRkR11RttR0msVV0R00Rtttttk(三)色谱分离的前提 KAKB 或kAkB 是色谱分离的前提。= t0(1+KA ) ARtmsVVBRt= t0(1+KB ) msVV tR= t0 (KAKB) msVVtR0 KAKBkAkB分配系数与色谱分离推导过程: 色谱理论需要解决的问题:色谱分离过程的热力学和动色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径,柱效力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径,柱效
13、与分离度的评价指标及其关系。与分离度的评价指标及其关系。组分保留时间为何不同?色谱峰为何变宽?组分保留时间为何不同?色谱峰为何变宽? 组分保留时间:色谱过程的热力学因素控制;组分保留时间:色谱过程的热力学因素控制; (组分和固定液的结构和性质)(组分和固定液的结构和性质) 色谱峰变宽:色谱过程的动力学因素控制;色谱峰变宽:色谱过程的动力学因素控制; (两相中的运动阻力,扩散)(两相中的运动阻力,扩散) 两种色谱理论:塔板理论和速率理论;两种色谱理论:塔板理论和速率理论; 塔板理论的假设:塔板理论的假设: (1) 在每一个平衡过程间隔内,平衡可以迅在每一个平衡过程间隔内,平衡可以迅速达到;速达到
14、; (2) (2) 将载气看作成脉动(间歇)过程;将载气看作成脉动(间歇)过程; (3) (3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略;试样沿色谱柱方向的扩散可忽略; (4) (4) 每次分配的分配系数相同。每次分配的分配系数相同。10-2-1 塔板理论- -柱分离效能指标柱分离效能指标 1.塔板理论(plate theory) 半经验理论;半经验理论; 将色谱分离过程比拟作蒸馏过程,将连续将色谱分离过程比拟作蒸馏过程,将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复 (类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程);(类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程); 色谱柱长:色谱柱长:L,
15、虚拟的塔板间距离:虚拟的塔板间距离:H, 色谱柱的理论塔板数:色谱柱的理论塔板数:n, 则三者的关系为:则三者的关系为: n = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为:理论塔板数与色谱参数之间的关系为:222116545)()(./bRRWtYtn保留时间包含死时间,在死时间内不参与分配保留时间包含死时间,在死时间内不参与分配! ! 2.有效塔板数和有效塔板高度 单位柱长的塔板数越多,表明柱效越高。单位柱长的塔板数越多,表明柱效越高。 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 组分在组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效时间内不参与柱内分配。需引
16、入有效塔板数和有效塔板高度:塔板数和有效塔板高度: 222/1)(16)(54. 5bRRWtYtn 理理有效有效有效有效有效有效nLHWtYtnbRR 222/1)(16)(54. 53.塔板理论的特点和不足 (1)当色谱柱长度一定时,塔板数当色谱柱长度一定时,塔板数 n 越大越大(塔板高度塔板高度 H 越越小小),被测组分在柱内被分配的次数越多,柱效能则越高,所,被测组分在柱内被分配的次数越多,柱效能则越高,所得色谱峰越窄。得色谱峰越窄。 (2) (2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同,用有效塔不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同,用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时,应指
17、明测定板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时,应指明测定物质。物质。 (3) (3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果,当两组分柱效不能表示被分离组分的实际分离效果,当两组分的分配系数的分配系数K K相同时,无论该色谱柱的塔板数多大,都无法分相同时,无论该色谱柱的塔板数多大,都无法分离。离。 (4) (4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果,也无法指出影响柱效的因素及提高柱效效不同的实验结果,也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。的途径。 10-2-2 速率理论-影响柱效的因素影响柱效的因素1. 速率方程 H =
18、 A + B/u + Cu H:理论塔板高度,:理论塔板高度, u:载气的线速度:载气的线速度(cm/s) 减小减小A、B、C三项可提高柱效;三项可提高柱效; 存在着最佳流速;存在着最佳流速; A、B、C三项各与哪些因素有关?三项各与哪些因素有关?A涡流扩散项 A = 2dp dp:固定相的平均颗粒直径:固定相的平均颗粒直径 :固定相的填充不均匀因子:固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小固定相颗粒越小dp,填充的越均匀,填充的越均匀,A,H,柱效,柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻,色谱。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻,色谱峰较窄。峰较窄。B/u 分子扩散项 B =
19、2 Dg :弯曲因子,填充柱色谱,弯曲因子,填充柱色谱,11。 Dg:试样组分分子在气相中的扩散系数(:试样组分分子在气相中的扩散系数(cm2s-1) (1) 存在着浓度差,产生纵向扩散存在着浓度差,产生纵向扩散; (2) 扩散导致色谱峰变宽,扩散导致色谱峰变宽,H(n),分离变差,分离变差; (3) 分子扩散项与流速有关,流速分子扩散项与流速有关,流速,滞留时间,滞留时间,扩散,扩散; (4) 扩散系数:扩散系数:Dg (M载气载气)-1/2 ; M载气载气,B值值。 k为容量因子;为容量因子; Dg 、DL为扩散系数。为扩散系数。 减小担体粒度,选择小分子量的气体作载气,可降低传质减小担体
20、粒度,选择小分子量的气体作载气,可降低传质阻力。阻力。C u 传质阻力项 传质阻力包括气相传质阻力传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力和液相传质阻力CL即:即: C =(Cg + CL)ggDdkkC2p22)1 (01. 0LfLDdkkC22)1 (322.载气流速与柱效最佳流速载气流速高时:载气流速高时: 传质阻力项是影响柱效的传质阻力项是影响柱效的主要因素,流速主要因素,流速 ,柱效,柱效 。 载气流速低时:载气流速低时: 分子扩散项成为影响柱效分子扩散项成为影响柱效的主要因素,流速的主要因素,流速 , ,柱效柱效 。H - u曲线与最佳流速:曲线与最佳流速: 由于流速对这两项完
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