荧光定量PCR实验技术干货课件.ppt
- 【下载声明】
1. 本站全部试题类文档,若标题没写含答案,则无答案;标题注明含答案的文档,主观题也可能无答案。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
2. 本站全部PPT文档均不含视频和音频,PPT中出现的音频或视频标识(或文字)仅表示流程,实际无音频或视频文件。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
3. 本页资料《荧光定量PCR实验技术干货课件.ppt》由用户(三亚风情)主动上传,其收益全归该用户。163文库仅提供信息存储空间,仅对该用户上传内容的表现方式做保护处理,对上传内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知163文库(点击联系客服),我们立即给予删除!
4. 请根据预览情况,自愿下载本文。本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
5. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007及以上版本和PDF阅读器,压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 荧光 定量 PCR 实验 技术 干货 课件
- 资源描述:
-
1、荧光定量荧光定量PCR技术及数据处理分析技术及数据处理分析项目部项目部内容概要内容概要荧光定量荧光定量PCR的原理的原理荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法荧光定量实验流程荧光定量实验流程荧光定量荧光定量PCR仪仪生工荧光定量产品选择指南生工荧光定量产品选择指南2荧光定量荧光定量PCR原理原理定义定义实时定量实时定量PCR技术:技术:利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩每一个循环扩增产物量的变化增产物量的变化,对,对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析与常规与常规 PCR技术比较:技术比较:对对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分
2、析,扩增反应的终点产物进行定量和定性分析,无法对起无法对起始模板准确定量始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测,无法对扩增反应实时检测3荧光定量荧光定量PCR原理原理标记方法标记方法4SYBR Green I4TaqMan Probe分子信标分子信标SYBR Green I 染料法染料法SYBR Green I5SYBR Green I是一种结合于所有是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。绿色激发波长的染料。5SYBR Green I 染料法染料法作用机理作用机理6 6SYBR Green I 染料法染料法融解曲线融解曲线7将温度与荧光强度的变化
3、求导将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT)原始图谱原始图谱对数图谱对数图谱7SYBR Green I 染料法染料法融解曲线融解曲线8融解曲线分析,单一融解曲线分析,单一峰无非特异性荧光:峰无非特异性荧光:定量准确定量准确融解曲线分析,出现融解曲线分析,出现杂峰其他产物出现非杂峰其他产物出现非特异性荧光:特异性荧光:定量不准确定量不准确8Taqman 探针法探针法原理原理95端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter, R) ,如,如FAM、VIC等等 3端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) ,MGB 为不发光的荧光基团为不发光的荧光基团探针完整,探
4、针完整,R发射的荧光能量被发射的荧光能量被Q基团吸收基团吸收 ,无荧光,无荧光, R与与Q分开,发荧光分开,发荧光Taq酶有酶有 53外切核酸酶活性,可水解探针,外切核酸酶活性,可水解探针,R与与Q分开,发荧光。分开,发荧光。 9Taqman 探针法探针法工作机理工作机理1010Taqman 探针法探针法PCRPCR体系的建立体系的建立引物、探针的设计:引物、探针的设计:探针探针Tm为为68-70, 30 bp, 5不能有不能有G, G可能会淬灭荧光素可能会淬灭荧光素引物尽量靠近探针引物尽量靠近探针, 扩增片段扩增片段400 bp, 引物引物Tm为为59-60反应参数的确定:反应参数的确定:一
5、般为:一般为:94 ,10-20S 60,30-60S(Taq酶酶53外切核酸酶活性在外切核酸酶活性在60 最高),也可通过温度梯度优化退火温度最高),也可通过温度梯度优化退火温度 优化引物和探针浓度:获得最小优化引物和探针浓度:获得最小Ct值,最大信号值,最大信号/背景比值背景比值引物浓度:引物浓度:100-900nM探针浓度:探针浓度:50-300nM 其他与常规其他与常规PCR相同相同1111实时荧光定量实时荧光定量PCR分类分类分子信标分子信标12标记荧光的发夹探针标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补环与目标序列互补茎由互补配对序列组成茎由互补配对序列组成环环茎茎荧光素荧光素 淬灭剂淬
6、灭剂12实时荧光定量实时荧光定量PCR分类分类分子信标分子信标13FRET13几种荧光定量几种荧光定量PCR方法的应用比较方法的应用比较1414荧光定量荧光定量PCR原理原理常用名词概念常用名词概念+扩增曲线扩增曲线+荧光阈值荧光阈值+Ct值值1515荧光定量荧光定量PCR原理原理扩增曲线扩增曲线16Cycle(循环数)(循环数)Rn(荧光强度)(荧光强度)BaselineLgliner phase平台期平台期荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件16荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光阈值荧光阈值17Cycle(循环数)(循环数)Rn(荧光强度)(荧光强度)BaselineLgliner p
7、hase平台期平台期 前前15个循环信号作为荧光本底个循环信号作为荧光本底信号(信号(baseline) 荧光阈值的缺省设置是荧光阈值的缺省设置是315个个循环的荧光信号的标准偏差的循环的荧光信号的标准偏差的10倍倍 手动设置手动设置:大于荧光背景值和阴大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值;进入指性对照的荧光最高值;进入指数期的最初阶段数期的最初阶段 真正的信号真正的信号:荧光信号超过阈值荧光信号超过阈值Threshold17荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值值18Cycle(循环数)(循环数)Rn(荧光强度)(荧光强度)Ct值的定义:值的定义:PCR扩增过程中,扩增产物扩增过程中,扩增
8、产物的荧光信号达到设定的阈值的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数时所经过的扩增循环次数Ct value 18荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值的重现性值的重现性19横轴:横轴:PCR反映循环数反映循环数纵轴:荧光信号量纵轴:荧光信号量 Ct值的特点:值的特点:相同模板进行相同模板进行96次扩增,终点处产物量不恒定;次扩增,终点处产物量不恒定;Ct值极具重现性值极具重现性19荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理20理想的理想的PCR反应反应XnX0 2n*Xn:第:第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量X0 :起始模板数量:起始模板数量n:
9、扩增循环数:扩增循环数20荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理21非理想的非理想的PCR反应反应 XnX0 (1En)n*Xn:第:第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量X0 :起始模板数量:起始模板数量n:扩增循环数:扩增循环数En:扩增效率:扩增效率21荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理22在扩增产物达到荧光阈值时在扩增产物达到荧光阈值时XCtX0 * (1En)CtM (1)整理方程式(整理方程式(2):):方程式(方程式(1)两边同取对数得:)两边同取对数得:XCt:荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量,在阈值设
10、定以后,:荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量,在阈值设定以后,它是一个常数,定为它是一个常数,定为MLog2MLog2X0 *(1En)Ct (2)Log2X0 = Log 2M - Ct Log2(1En)22荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值与起始模板量的关系值与起始模板量的关系23Cycle numberCk 104Ck 102SampleLg of DNA concentration 模板模板DNA量越多,荧光达量越多,荧光达到阈值的循环数越少,即到阈值的循环数越少,即Ct值越小。值越小。 Log模板起始浓度与模板起始浓度与Ct值值呈线性关系。呈线性关系。23荧光定量荧光定量PC
11、R原理原理荧光定量反应性的确认荧光定量反应性的确认24 线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认 相关系数(相关系数(R2):大于):大于0.98 标准曲线斜率:标准曲线斜率:-3 -3.5 PCR扩增效率(扩增效率(E):):0.9-1.2 检测灵敏度确认检测灵敏度确认 35Cycles内可得到好的定量结果内可得到好的定量结果 如果采用如果采用SYBR检测方法,检测方法,30Cycles内无非特异性产物扩增内无非特异性产物扩增 No template control确认确认 35 Cycles内无引物二聚体产生内无引物二聚体产生24荧光定量荧光定量PCR技术的主要应用技术的主要应用 定性
12、分析研究定性分析研究:杂合或纯合子鉴定,(:杂合或纯合子鉴定,(SNPs)分析等)分析等 绝对定量研究绝对定量研究:病毒和病原菌定量分析,基因拷贝数定量:病毒和病原菌定量分析,基因拷贝数定量,GMO定量检测等定量检测等 相对定量研究相对定量研究:mRNA表达量分析,表达量分析,siRNA效果确认,差效果确认,差异显示结果验证等异显示结果验证等2525荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法1绝对定量解析方法绝对定量解析方法1相对定量解析方法相对定量解析方法2626绝对定量的定义绝对定量的定义27Sample25 Log(起始浓度)与循环数呈线性关系,通过已知起始拷贝数的(起始浓度)与循环数呈
13、线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品标准品 可作出标准曲线可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品根据样品Ct值,就可以计算出样品中所含的模板量值,就可以计算出样品中所含的模板量27绝对定量分析几要素绝对定量分析几要素28一个一个目的基因目的基因 即需要确定其量值的核酸序列。即需要确定其量值的核酸序列。一组一组标准样本标准样本 用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组产物、基因组DNA等。等。重复反应孔重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应,以确保统建议每个样本使用三个或更多重
14、复反应,以确保统计显著性。计显著性。标记方法的选择标记方法的选择 SYBR Green I 法或法或Taqman 探针法均可。探针法均可。实验结果显示实验结果显示 扩增曲线;标准曲线;融解曲线扩增曲线;标准曲线;融解曲线(探针法不需要探针法不需要)。28绝对定量质粒标准品的制备绝对定量质粒标准品的制备29PCR目的基因克隆目的基因克隆目的基因目的基因目的基因目的基因质粒质粒基因组基因组DNA质粒提取,质粒提取,OD值定量,将质粒梯度稀释作为标准品使用值定量,将质粒梯度稀释作为标准品使用29质粒标准品稀释方法质粒标准品稀释方法30倍比梯度稀释方法:倍比梯度稀释方法:1v原液原液(标准品标准品i)
展开阅读全文