扩增基因全长实验技术.课件.ppt

1、扩扩增增基基因因全全长长实实验验技技术术获取基因全长简介获取基因全长简介 基因初步验证基因初步验证 基因全长获取（基因全长获取（RACE技术）技术） RACE产物鉴定产物鉴定 4123以介绍以介绍5RACE技术为主技术为主5对序列进行生物信息学分析对序列进行生物信息学分析 目录目录v为什么要获取基因全长？为什么要获取基因全长？v什么是什么是EST？v获取基因全长基本流程？获取基因全长基本流程？ 获取基因全长简介获取基因全长简介EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标表达序列标签签是从一个随机选择的是从一个随机选择的cDNA 克隆，进行克隆，进行5端和端和3端单一次测序

2、挑选出来获得端单一次测序挑选出来获得的短的的短的cDNA 部分序列部分序列,代表代表一个完整基因的一小部分一个完整基因的一小部分,在在数据库中其长度一般从数据库中其长度一般从20 到到7000bp 不等不等,平均长度为平均长度为360 120bp 。 获取全长获取全长cDNA是研究是研究基因功能的关键，是基因功能的关键，是进行基因功能及产物进行基因功能及产物分析的必要前提。分析的必要前提。获取基因全长基本流程获取基因全长基本流程构建数据库构建数据库筛选筛选EST序列序列普通普通PCR进行初步验证进行初步验证RACE技术技术生物信息学分析生物信息学分析库库筛选筛选EST基因初步验证基因初步验证获

3、取基因全长获取基因全长进行全序列分析进行全序列分析以本实验室具体情况为例子以本实验室具体情况为例子生物信息学分析生物信息学分析1. Blast比对比对2. ORF比对比对3. 相似序列相似序列多重比对多重比对4. 家族成员家族成员多重比对多重比对PCR扩增扩增凝胶回收凝胶回收测序测序设计引物设计引物提取提取RNA反转录反转录PCR扩增扩增电泳检测电泳检测凝胶回收凝胶回收电泳检测电泳检测克隆克隆uPCR产物测序u凝胶回收测序u克隆后菌液测序u克隆后质粒测序基因初步验证基因初步验证RACE技术技术方法方法RACE 简介简介试剂盒试剂盒选取选取5RACE原理原理实验实验过程过程基因全长获取基因全长获

4、取cDNA末端快速扩增末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于技术是基于PCR技术由已知的部分技术由已知的部分cDNA序序列来获得完整列来获得完整cDNA序列的一种方法。序列的一种方法。分为分为3RACE 和和5RACE RACE 简介简介Clontech公司公司全称全称：SMART RACE cDNA amplification kit 优点：优点：操作简便，成功率较高，全长分子的比例较高操作简便，成功率较高，全长分子的比例较高 价钱：中等偏上。价钱：中等偏上。缺点：缺点：不知道能否拿到完整的不知道能否拿到完整的5UTR.试剂盒试

5、剂盒选取选取5RACE原理原理5polyA 3Oligo(dT)primer5polyA 3cDNA第第一一条条链链合合成成机机制制polyA 3polyA 3355RACE原理原理polyA 353LUPSuppression PCR:阻抑聚合酶反应阻抑聚合酶反应535335GSP13GSP1SUP55353实验实验过程过程合成合成cDNA第一条链第一条链（1）制备）制备A管：加好后放在室温下。共计管：加好后放在室温下。共计4ul。 2.0ul 5X First-Strand Buffer 1.0ul DTT(20 mM) 1.0ul dNTP Mix(10 mM) 4.0ul Total

6、Volume（2）制备）制备B管：冰上操作。管：冰上操作。 1.0-2.75ul RNA 1.0ul 5-CDS Primer A 再加入无菌水，使体积达到再加入无菌水，使体积达到3.75ul。 混合溶液，并用掌上离心机离心。混合溶液，并用掌上离心机离心。72 3分钟，分钟，42 2分钟。分钟。此过程可在此过程可在PCR仪中进行。之后仪中进行。之后14000g离心离心10s。如果是做。如果是做5RACE，则加入，则加入1ul SMARTer IIA oligo。 此时此时B管体积为管体积为4.75ul。实验实验过程过程合成合成cDNA第一条链第一条链（3）在上一步放入）在上一步放入PCR仪中后

7、，在之前放在室温下的仪中后，在之前放在室温下的A管管中加入：（室温进行）中加入：（室温进行）0.25ul RNase Inhibitor(40 U/l) 1.0ul SMARTScribe Reverse Transcriptase(100 U)加上之前加上之前A管中的管中的4ul，此时总体积为，此时总体积为5.25ul。 （4）将）将A管中的混合液体管中的混合液体5.25ul加入到加入到B管管4.75ul中。使体积中。使体积达到达到10ul。缓慢吸打混合，离心至管底部。之后将管放在。缓慢吸打混合，离心至管底部。之后将管放在PCR仪中仪中4290分钟。分钟。7010分钟。分钟。（5）在管中加入

8、）在管中加入Tricine-EDTA Buffer 100ul。（在总。（在总RNA的的浓度浓度200ng时）时） -20保存保存3个月。个月。RACE PCRv 每每50ul的体系中先合成的体系中先合成41.5ul的的Master Mix: 34.5ul PCR-Grade Water 5.0ul HiFi PCR Buffer 1.0ul dNTP 1.0ul HiFi Mix实验实验过程过程v PCR反应体系：反应体系： 5RACE ready cDNA : 2.5ul UPM（10*）：）：5ul GSP1（10uM）：）：1ul Master Mix：41.5ul Total：50u

9、l实验实验过程过程RACE PCRv PCR反应程序：反应程序： 94 3min 30cycles 94C 30 sec 68C 30 sec 72C 3 min 72 10min 4 +4种方法凝胶回收凝胶回收对对PCR产物进行凝胶回产物进行凝胶回收，确认片段大小，对收，确认片段大小，对回收产物进行测序。回收产物进行测序。产物位置、大小产物位置、大小比较比较GSPs和和NGSPs作为引物时扩增得到作为引物时扩增得到的产物。的产物。 克隆测序克隆测序对对RACE产物进行克产物进行克隆测序，建议选取隆测序，建议选取8-10个克隆进行测序。个克隆进行测序。Southern Blot 对对Southern杂杂交结果进行分析交结果进行分析RACE产物的鉴定产物的鉴定谢谢谢谢