类型荧光染料激发与发射波长课件.ppt

1、活体成像技术实验设计与应用介绍 内容简介一、活体成像技术简介定义定义: : 活体状态下在细胞和分子水平上应用影像学方法对生物过程进行空间和时间上的定性、定量分析研究的一门科学。活体成像定义Dr. Ralph Weissleder细菌感染模型建立金黄色葡萄球菌荧光标记探针靶向细菌DPA-Cy7荧光成像在细菌研究中的应用Pre-injectionPost-injection6 h12 h18 h21 hLeevy, W. M.; Marquez, M.; Piwnica-Worms, D.; Smith, B. D. Bioconjugate Chem.2008,19,686692.终极方法终极方

2、法无损伤性无损伤性直观形象直观形象活体成像的优点药物材料研究药物材料研究新药评价新药评价纳米药物纳米药物核酸疫苗核酸疫苗骨科材料骨科材料生物材料生物材料生命科学研究生命科学研究肿肿 瘤瘤微生物微生物干细胞干细胞心脑血管心脑血管疾病模型疾病模型生物发光荧光成像同位素X光、白光成像对象细胞细胞、分子分子动物或器官优点噪音低应用广泛影响小结构清晰缺点缺点构建繁琐成本昂贵噪音大资质许可无功能信息常用活体成像模式功能成像（荧光）与结构成像（X光）的组合运用 X光成像 Kodak X-Sight 761 overlay数码X光成像的精确定位 -结构成像与功能成像相结合Courtesy Dr. B. Bed

3、nar , Merck Co. Inc.正面成像侧面成像 数码X光成像的精确定位 -结构成像与功能成像相结合多模式活体成像多模式活体成像多模式活体成像：成像过程中至少同时采用一种结构成像和一种功能成像的组合成像方式。结构成像功能成像多模式成像X光 荧光成像 + 生物发光 + 同位素成像结构成像 功能成像CT PET+SPECT例如：多模式活体成像应用举例 -生物发光、荧光与X光的组合运用Backer MV, et al., 2007. Vol13(4), April 2007. p504-9.生物发光、荧光成像和生物发光、荧光成像和X X光成像组合运用的成功范例，已成光成像组合运用的成功范例，

4、已成为肿瘤等研究的经典方法为肿瘤等研究的经典方法Nature MedicineZhi Yang, Chun Li, Biomacromolecules 2007，8（11）In111-DTPA-CCPM多模式活体成像应用举例 -荧光与同位素成像的组合运用生物发光（ fire），近红外成像（ rainbow ），同位素成像（111In-LS308）Mol Imaging, 2009. 8(2): p. 101-10 多模式活体成像应用举例 -发光、荧光与同位素成像的共定位1、荧光成像基态 激发态 发射态激发光发射光光能 光能 标记生物大分子：标记生物大分子：蛋白、抗体、多肽、核酸； 标记小分子化

5、合物：标记小分子化合物：小分子化合物； 标记细胞：标记细胞：肿瘤细胞、干细胞等； 标记纳米化药剂：标记纳米化药剂：脂质体、胶束等； 标记其他纳米材料：标记其他纳米材料：金属氧化物等; 标记细菌：标记细菌：各种感染模型; 标记脏器：标记脏器：ICG;标悍的荧光荧光成像应用荧光成像的关键因素穿透率小鼠不同部位的穿透率650-850nm是活体成像的核心波段 420 ex / 790 em 440 ex / 790 em 460 ex /790 em 480 ex / 790 em 520ex / 790 em 540 ex / 790 em 570 ex / 790 em 590 ex / 790

6、em 600 ex /790 em 610 ex / 790 em 620 ex / 790 em 630 ex / 790 em 650 ex / 790 em 670 ex / 790 em 690 ex / 790 em 700 ex / 790 em 710 ex / 790 em 720 ex / 790 em 730 ex / 790 em White Light X-Ray波长对背景噪音的影响近红外成像-荧光成像的最佳选择不同波长激光笔对大拇指的透光实验定义： 生物发光是荧光素酶（Luciferase）以荧光素（Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O2为底物，在Mg 2存

7、在时发生酶促反应中产生光子的过程。 荧光素+ ATP+ O2核黄素磷酸盐+醛化合物 核黄素磷酸盐+醛化合物激发的络合物 激发的络合物氧化核黄素磷酸盐+酸+水+光子 化学能光能2、生物发光生物发光的应用1.1. 细胞或细菌标记：细胞或细菌标记：肿瘤细胞、干细胞等记； 最新技术：生物发光与荧光蛋白双标2.2. 基因表达：基因表达：以融合蛋白的方式标记内源性蛋白，研究基因表达情况；3.3. 蛋白相互作用：蛋白相互作用：将荧光素酶基因分为两个片段，分别与要研究的两个蛋白融合表达，两种蛋白相互靠近后产生发光。3、X-Ray 成像0.0 mm0.1 mm0.2 mm0.4 mm0.8 mm 1.41.61

8、.82.12.5Binning 1 x 1, Acq. Time 100 sBone/Soft Tissue二、活体成像实验设计活体成像实验设计实验设计理论方面：实验设计理论方面： 成像模式的选择：结构成像与功能成像组合 不同研究水平的相互组合：活体、离体、分子水平实验设计实践方面：实验设计实践方面： 染料的选择：类型、波长 标记方法的选择：共价键、非共价键、脂质体 荧光单一波长与多光谱分析选择: 近红外 荧光素酶基因标记的细胞株不同研究水平的相互组合三个水平一致的数据，才是更加真实有效的数据。三个水平一致的数据，才是更加真实有效的数据。 活体水平 离体脏器水平细胞分子水平近红外荧光染料举例类

9、型类型荧光染料荧光染料激发与发射波长激发与发射波长(nm)亲水染料ICG795/835Cy系列（如CY7）CY7：743/770Alexa 系列（如750）750：749/775疏水染料DiR748/780稀土染料Er980/655QdotQdot800450/800报告基因的选择成像模式成像模式基因基因激发与发射波长激发与发射波长(nm)说明说明生物发光Fluc560需要注射底物Rluc475需要注射底物荧光mKate2588/633近红外波段近红外波段TagRFP555/584红/橙TagYFP508/524黄TagGFP2483/506 绿注：荧光蛋白的信息来源于注射麻醉：腹腔注射：如戊

10、巴比妥钠（1%，7 L/g）气体麻醉：小动物麻醉机：如异氟烷（2-5%）动物麻醉方式的选择注意事项：注意事项：l小动物麻醉程度适度：麻醉过深加大死亡概率、剂量不足会出现抽搐l反复麻醉易导致死亡；注意麻醉动物的保温l小动物存在种属和个体差异，不同动物模型使用剂量不同l戊巴比妥等麻醉剂溶液长时间放置容易失去药效。脱毛方式脱毛方式：剃刀、电动剃毛器化学脱毛剂脱毛剂脱毛剂：人用脱毛剂-带自发荧光自配脱毛剂：8% NaS + 30% 无水乙醇注意事项：注意事项： 适量涂抹；清洗；适量配备；低温、 避光、密闭保存；脱毛原因：脱毛原因：荧光拍摄时毛发产生背景噪音 并影响光的穿透脱毛方法的选择底物注射方式底物

11、注射方式：一般通过腹腔注射打入底物(150g/g)，偶尔也可原位注射;生物发光时间生物发光时间：注射底物约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光；十五分钟后强度达到最高；发光持续时间发光持续时间：最高点持续约2030分钟后开始衰落，约三小时后发光全部消失；最佳检测时间最佳检测时间：注射后12到25分钟之间;麻醉时间麻醉时间：发光底物注射后7-8min开始麻醉;生物发光成像时间点的选择文献检索染料的激发发射波长和特点体外用多光谱拍摄模式寻找最佳激发发射波长和最适浓度。使用黑色底透板拍摄（costar，货号3603），EP管对结果有一定影响体外数据作为参考，在体拍摄预实验也要用多广谱拍摄再优化一下拍摄

12、参数（光的穿透和背景噪音等的影响）荧光成像实验的注意事项预实验的重要性预实验的重要性一、预实验前的工作一、预实验前的工作：1. 动物模型的建立：荷瘤模型、疾病模型 2. 仪器兼容性：配套滤光片 3. 待用的试剂和耗材：麻醉剂、脱毛膏、注射器、手术工具等 二、预实验中的工作二、预实验中的工作：1. 了解动物：动物模型、荧光背景、麻醉、脱毛等2. 了解标记物：如荧光及发光强度、纯度、浓度3. 了解自己的实验操作能力：尾静脉注射4. 了解仪器：拍摄参数确定和程序设置5. 了解拍摄时间点：研究对象体内半衰期注意对照的选择，特别是自身对照（给药前拍一下本底）和阴性对照，有条件的还要设置阳性对照Proto

13、col拍摄后应立即简单做一下叠加，以免动物小幅度爬动影响图像的叠加动物有可能会排泄，所以看到明显的杂信号时，最好在那个部位用酒精等擦拭一下拍摄不同脏器时，注意多选几个体位注意离体脏器数据的收集，必要时固定、切片正式实验的注意事项三、活体成像应用举例荧光成像在纳米材料研究的应用Medarova Z, et al., 2007. Vol13(3), March 2007. p372-7.纳米材料介导的肿瘤药物主动靶向肿瘤药物靶向性实验0h2h4h 6h 8h 12h 24h 32h 36h 48h 72h58h020004000600080000 51 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6

14、7肝脏肿瘤肿瘤药物注射11h时生物发光、荧光与X光图像叠加 。BLINIRFMerge肿瘤药物靶向实体瘤实验 -生物发光、荧光和X光成像三重叠加Zeng et al. Cancer Research, 2006, 9566-9575红色荧光蛋白RFP标记的前列腺癌生物发光在乳腺癌研究中的应用X光成像生物发光叠加X光生物发光在肝癌研究中的作用X-ray + lucWhite light + lucFOV 110cmFOV 3cm生物发光在肺癌研究中应用局部高清晰成像，有效识别两个相距很近的肿瘤小鼠眼部病毒转染的生物发光成像小鼠关节高清晰X光成像Bones小鼠关节放大X光大鼠爪子高清晰成像最高分辨率达50线/毫米！Visipaque进行小鼠心肾高清晰X光造影 Images Courtesy of USC Core Imaging Facility