HIV实验室质量管理解读课件.ppt

1、艾滋病实验室质量管理实验室质量管理行政支持 行政部门和领导 HIV实验室建设和发展 资金 人员 监督支持人员培训 每年市疾控中心组织 上岗证环境条件：实验室的设置及其建筑、设施、设备必须符合全国艾滋病检测工作管理办法的要求。HCV，HBV及梅毒等血清学检测在满足实验室管理要求和保证生物安全的条件下，可以与HIV检测共享空间和设备，应避免交叉污染。实验室质量管理样品采集、运送和处理送检单收样登记表HIV抗体复检检测单检测方法和试剂的选择试剂的出入库及使用记录供应品、耗材（试剂）质量验收记录表实验室质量管理设备维护与校准仪器设备温度记录表仪器设备使用、检定、维修、维护记录本强检计量器具周期检定（自

2、校）计划表文件和文件管理实验原始记录表结果报告样品登记和保存（唯一编码）实验室质量管理文件和文件管理标准操作程序（SOP）（1）样品的接收、登记、处理、保存和运输；（2）检测方法和步骤；（3）试剂使用和保存；（4）仪器的使用维护和校准；（5）质量控制要求及程序；（6）结果解释与报告；（7）保密程序；（8）实验室数据、相关文件记录与保存；（9）不确定样品追踪和处理；（10）实验室安全防护及实验室的清理和消毒。文件存档（保存10年以上）ELISA实验影响因素酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素样品溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性 可能是溶血血清中含有过氧化酶物质（红细

3、胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使过氧化氢释放出原生态氧，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，即显蓝色，产生假阳性。轻微溶血没事，严重溶血的标本易产生假阳性。受细菌污染的标本因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素样品塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性 ，最好使用真空采血管或抗凝管。（抗凝剂会略有影响，但影响不大）标本凝固不全 在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清

4、，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素按说明书要求，实验前应取出试剂稳定加样加样的量要准确 移液器要经常清洗 定期校准加样位置 孔壁1/3以下 不可溅出 不可产生气泡必须使用一次性TIP头，严格控制，防止交叉污染先加稀释液的，加样时可用移液器孔内吹打混匀移液器的校准可以送检，可以自校，自校要有SOP有记录酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素孵育时间 严格按照试剂盒说明书操作 容易控制温度 严格按照试剂盒说明书操作 用校准的温度计监测温度，特

5、别是冬天，避免因温度过低导致假阴性。封板 孵育时不贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁,难以清洗彻底。恒温孵育设备的使用与维护校准的温度计监测ELISA反应温度水浴的尤其要注意水位酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素洗板洗液的量 试剂不同，板孔的大小差异会导致洗液的量的不同，为保证洗的彻底，原则是量足够多且不会逸出。浸泡时间 严格按照试剂盒说明书操作，一般30-60秒，不设置浸泡时间或时间太短，洗脱不彻底的话会产生“花板”。 保持针孔通畅不阻塞 血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机的针孔处于阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”。应做好洗板机的维护工作。

6、拍板酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素洗板机的检定、使用及维护检定：注液量和残留量（每孔5微升）使用：设置程序（注液量、洗板次数、浸泡时间、洗板位置）维护：消毒液冲洗，蒸馏水冲洗酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素显色加底物时，应悬空加液，避免触及板孔内壁造成交叉污染。应先加底物缓冲液A再加TMB(四甲基联苯胺)底物B，加入顺序不能颠倒。已显浅蓝色的TMB底物坚决不能用。个别试剂要求A、B液先混合后再加。温度与时间的控制。酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素终止及读板读板前应保证板孔底部干净，无异物，无水气，无气泡，特别是在冬天。酶标仪不应放置在阳光或强光照射下,操作时室温宜在1

7、5-30,使用前先预热15-30 min,测读板结果会更稳定。酶标仪必须检定 标准板厂家酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素Cutoff值计算及结果判定注意事项严格按照试剂说明书要求的数量做阴、阳性对照根据阴、阳性对照的值判定实验是否成立严格按照试剂说明书要求计算Cutoff值注意空白原始记录标明空白对照、阳性对照、阴性对照、外部对照以及待检样品的位置试剂盒厂家、测定方法、批号、效期操作人员和复核人员姓名（签名）检测日期其他（环境、设备、实验依据等）注意样本的溯源性废弃物处理消毒液（含氯消毒剂、75%乙醇、2%戊二醛）干烤消毒（140 2-3h）高压蒸汽消毒（121 15-20min）高压

8、灭菌器检定：温度和压力高压灭菌器使用效果监测：化学指示卡，生物监测（嗜热脂肪杆菌芽孢）ELISA实验质量控制ELISA的质量控制试剂盒内部对照：试剂盒内部对照质控品即为试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清。试剂盒内部对照用于判断每次实验的有效性，但不能作为室内质控品使用。每一次检测临床样品时，必须有试剂盒内部对照，而且只能在同批号的试剂盒中使用。内部对照结果无效，必须重新试验。室内质控品：为非试剂盒组份的外部质控品，是为了监控检测的重复性而设置的，包括强阳性、弱阳性和阴性质控血清。也可以只设置一个弱阳性质控，以该试剂盒临界值（Cut-off）的23倍为宜。外部质控品的作用是，判断该批临床样品检测的

9、有效性，因此，每次实验必须包含室内质控品，其结果无效，必须重新试验。室内质控品的来源商品化的室内质控品 实验室自己制备（比较经济）混合试剂盒内部对照血清，通过做实验确定阴阳性对照的混合比例，混合，分装保存。混合HIV抗体阳性人血清、HIV抗体阴性人血清，3000转/分钟离心15分钟，0.2m生物滤膜过滤除菌，5630分钟加热灭活处理。通过做实验确定阴阳性血清的混合比例，混合，分装保存。高浓度商品化室内质控品再稀释室内质控品的保存一次购买或制备量应该足够本实验室至少一年使用等量分装，可以按单次使用、单日使用、最长一周使用的量确定每个分装的量不同室内质控品应做好标记，最好使用不同颜色的标签，以防止

10、混用应存放于-70以下，如无条件则存放于非自动除霜的-20冰箱一旦融解后应存放于2-8，一周后必须弃去，不能重新冻存使用样品的采集、处理、保存、运送及接收样品的采集和处理建议用K2EDTA K3EDTA 枸橼酸钠的抗凝管采血,不用肝素抗凝管采血血浆 1500-3000r/min离心15min，吸上层血浆血清 室温自然放置1-2h，待血液凝固、血块收缩后1500-3000r/min离心15min，吸上层血清样品的保存建议用1.5ml-2.0ml的螺口冻存管或离心管保存.抗体及抗原检测的血清或血浆样品 应存放于-20以下,一周内检测的样品2-8 样品的保存尽量多分装保存样品的运送要求样本量1ml样

11、本的质量 无严重溶血，无微生物污染，无血脂过多，无严重黄疸等管子的质量 防漏三层包装 单管包装重新采样样品的运送要求样品和送检单分开专人送样 专门运送箱（实验室人员号码和联系方式）市疾控确证实验室血清or血浆2-8度运送或者冻存状态下直接运送送样单要求送样单打印检测者/审核者手签，单位或实验室盖章信息完整(真实姓名、送检人群、身份证号码、联系电话、现地址及户籍地址等)详细的样本来源(监管场所的具体到哪个监管场所)充分利用备注栏规范性(试剂、cutoff值等)样品的接收打开包装，注意生物安全，个人防护核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏记录 一般记录，另外记录有无严重溶血，微生物污染、血脂

12、过多及黄疸等情况开盖 生物安全柜中，个人防护HIV抗体检测HIV抗体检测的目的HIV抗体检测可用于诊断诊断、血液筛查血液筛查、监测监测等。以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。HIV抗体检测的要点根据目的选择检测方法及检测策略。严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。筛查试验阳性，须做确证试验。筛查试验阴性，不应做确证试验。HIV抗体筛查试验流程样 品初筛试验初

13、筛试验筛查试剂阳性反应阴性反应复检试验复检试验原有试剂+另一不同原理（或厂家）试剂或另外两种不同原理（或厂家）试剂一阴一阳均阴性反应均阳性反应确证试验报告阴性筛查试剂国家食品药品监督管理局注册批准ELISA试剂批批检合格，在有效期内推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂初筛试剂 高敏感性复检试剂 高特异性筛查样品血清血浆全血DBS/DPS唾液尿液筛查方法酶联免疫吸附实验（ELISA）第三代试剂 双抗原夹心法 单纯检测HIV抗体第四代试剂 抗原抗体联合诊断试剂 同时检测P24抗原和抗HIV-1/2抗体 缩短窗口期 注意复检试剂的选择注意复检试剂的选择化学发光或免疫荧光试验快速检测（RT）筛

14、查试验的结果报告HIV抗体筛查试验阴性反应报告为“HIV抗体阴性”HIV抗体筛查试验阳性反应报告为“HIV抗体待复检”HIV抗体复检试验两次检测均阴性报告为“HIV抗体阴性”HIV抗体复检试验两次检测均阳性或一阴一阳报告为“HIV抗体待确证”HIV感染产妇所生婴幼儿婴儿会由于被动携带母亲的抗体而连续几个月至十几个月出现抗体阳性。婴儿满12个月进行第一次HIV抗体检测。使用两种不同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测，两种筛查试剂检测结果均为阴性反应，报告HIV抗体阴性，可排除感染。检测结果出现阳性反应（一种为阴性反应一种为阳性反应或两种均阳性反应），不能排除感染，应继续追踪随访，至儿童满18个月

15、时再次进行HIV抗体检测。HIV感染产妇所生婴幼儿婴儿满18个月时应再次进行HIV抗体检测。使用两种不同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测。两种筛查试剂的检测结果均为阴性反应，报告HIV抗体阴性，可排除感染。检测出现阳性反应（一种为阴性反应一种为阳性反应或两种均呈阳性反应），进一步进行确证试验，根据确证试验的结果判断是否感染HIV。做好检测后咨询。HIV抗体检测结果解释HIV抗体阴性未发生感染（排除“窗口期”）HIV抗体不确定非特异性的反应感染早期感染晚期HIV抗体阳性发生感染（排除疫苗使用）HIV抗体快速检测HIV抗体快速检测快速检测，是艾滋病实验室多了一种检测方法快速检测，是为了更多更快的

16、发现感染者快速检测，不是为了取代实验室，但不能因为有了实验室而放弃使用快速检测快速检测手段能否成为新型检测-咨询模式，或基于医疗机构的有效的检测方法-取决于检测的质量HIV抗体快速检测方法PA明胶颗粒凝集试验（PA）：将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用。当待检样品含有HIV抗体时，明胶颗粒与抗体发生凝集反应，根据凝集情况判读结果。PA试剂有两种:同时检测HIV-1和HIV-2抗体以及分别检测HIV-1和HIV-2抗体。有效试验必须有阴性和阳性质控。HIV抗体快速检测方法免疫渗滤试验免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验。以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状

17、固定在膜上，加待检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10分钟以内。有效试验的质控点必须显色。HIV抗体快速检测方法免疫层析试验免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固定在膜上，待检样品（血液或唾液）沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。结果判读严格参照试剂说明书反应区和质控区均出现红色条带为阳性。质控区有条带，反应区无条带为阴性。质控区无条带则实验无效。HIV抗体快速检测的外部质控 外部对照质控品，可采用商用质控品或自制质控品。质控品应包含抗体阳性样品和阴性样品。自制质控品可使用本室保留的阳性样品。不能使用酶联试验的外部

18、质控品。下列情况需做质量控制：更换试剂批号；更换检测人员；更换包装；每个检测日；更换试剂厂家。 建议：每个检测日检测一次阳性和阴性质控品；如果日检测量大于50份样品，至少应作2次质控。快速检测的注意事项不提倡个人在家中检测。应由经培训的专业人员操作，注意生物安全操作，避免职业暴露发生。在质控窗口内应出现质控带，如实验完成后未呈现质控带，说明试剂盒内质控无效，该试验结果无效，样品须重检。出现以下问题，提示存在质量隐患，应引起重视：运输包装、内盒或试剂盒的物理损伤；在单包装内存在混杂物质；标签出现错误、缺失或字迹模糊 （特别是产品名称或出产厂家名称，批号和货号，失效期或/和生产日期）；缺失目录；泄

19、漏或污染；不适宜的存放条件；保护包装纸破损或污染。快速检测的注意事项环境温度,尤其是在冬天血清/血浆 全血 稀释缓冲液样本的量反应的时间生物安全 废弃物处理做好实验的原始记录不同厂家的快检试剂操作要求厂家厂家样品要求样品要求血量血量(ul)(ul)样品稀释样品稀释是否加缓是否加缓冲液冲液最小反应最小反应时间时间( (分钟分钟) )最大反应最大反应时间时间( (分钟分钟) )试剂储存要试剂储存要求求明胶颗粒法明胶颗粒法(PA)(PA)血清血清/ /血浆血浆25251:321:32N N120120/ /2-102-10DETERMINEDETERMINE血清血清/ /血浆血浆/ /全血全血505

20、0N N用全血时用全血时加加1 1滴滴151560602-302-30SDSD血清血清1010N NN N5 520201-301-30杭州艾康杭州艾康血清血清/ /血浆血浆/ /全血全血2525N NY Y101020202-30,2-30,勿勿冻存冻存上海科华上海科华血清血清/ /血浆血浆4040N NY Y/ /30304-304-30厦门新创厦门新创血清血清/ /血浆血浆/ /全血全血6060N NY Y1 130304-304-30广州万孚广州万孚血清血清/ /血浆血浆/ /全血全血80-10080-100N N用全血时用全血时加加2 2滴滴101030304-30,4-30,勿勿冻

21、存冻存北京万泰北京万泰血清血清/ /血浆血浆8080N N用全血时用全血时加加1 1滴滴/ /3030室温储存，室温储存，可置可置2-8 2-8 引起假阳性的原因使用溶血性样本 试剂存储条件不正确判读时间超过规定的判读时间 来自人体的非特异的交叉反应 等引起假阴性的原因HIV抗体的低滴定-只要能看到有线，即使很淡都应该判断为阳性 试剂存储条件不正确环境温度太低未到规定的判读时间试剂暴露在高湿度环境中 等HIV抗体快速检测的优点样本类型广可用全血 (指尖血) 操作更快 不需要成批实验不需要使用特殊仪器检测的当天就给出结果 提高受检人在检测后取回检测结果的比例快速试剂使用中存在的问题敏感性、特异度低于ELISA。技术上属于主观判读，不具备标准化条件，人员判读结果需要一定的经验。价格是ELISA的数倍。 可能存在较大的批间差异。检测点常规检测流程图-两种快检试剂检测点应急检测流程图-两种快检试剂职业暴露、孕妇产时和手术前等检测点快速检测流程图-一种快检试剂Thank you