激光共聚焦使用手册讲解课件.ppt

1、11激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜FV1000- 光谱扫描型光谱扫描型 -(倒置显微镜倒置显微镜IX81)简易使用说明书简易使用说明书22启动系统3显微镜镜下观察微分干涉差观察 4荧光观察 5取图的操作界面 6如何取图XY平面单标 7XY平面双标 同步扫描方式 10序列扫描方式 13XY平面单标 + 微分干涉差16XYZ扫描双标 19XYL光谱扫描 212D 操作界面 24图像分析打开文件 243D图像的叠加 25比例尺的使用 263D图像的重建 273D图像的旋转 29Unmixing31保存图像 35保存到CD-R36关闭系统37附录 38331. 打开计算机.2. 打开激光器.(打开钥

2、匙开关.)2-1. 多线氩离子 (458 nm, 488 nm, 514 nm) ON(打开电源开关后,打开钥匙开关.)2-2. 氦氖绿 (543 nm) ON2-3. 氦氖红 (633 nm) ON3.打开汞灯电源开关.4.登陆 Windows XP系统.5.双击快捷方式： 打开 FV10-ASW应用软件.* 系统软件的启动需要等待一定时间.5231User ID:AdministratorPassword: fluoview User ID:AdministratorPassword: Administrator 44 微分干涉差观察微分干涉差观察 1. 使用手控面板选择物镜. (参照 M

3、emo.)2. 插入起偏镜.3. 插入微分干涉滑块.4. 点击FV10-ASW软件中的图标.5. 标本聚焦.Memo按照7-1的操作转换物镜的倍率之后，对：物镜各物镜对应的DIC元件*进行操作.*DIC 元件1234Note 1. 使用TD滑块控制卤素灯的光强.Note 2. 检查滤色片转盘的位置是否为“6.DICT” .如果不是,用手柄按下DICT图标. Note 1手控面板用此旋钮进行微分干涉法对比度的调节.55 荧光观察荧光观察 123Hand switch1. 使用手控面板选择物镜.2. 点击FV10-ASW软件中的图标.3. 使用手控面板选择荧光滤色片. (参照 Memo.)4. 标

4、本聚焦.Note 2Notes 1 & 3Note 1. 选择第3步后,显微镜进入荧光观察状态. 注意此时汞灯的机械快门要打开. (建议通常机械快门要放在关闭的位置 () .)Note 2. 检查DIC滑块是否拉出.Memo关于荧光滤色片NIBA：蓝色激发/绿色荧光（例：FITC、EGFP等）WIG ：绿色激发/红色荧光（例：Rhodamine、DsRed等）Note 3. 观察之前，检查汞灯的机械快门要放在开启的位置 ().66图像的拇指索引明场观察 (显微镜镜下观察) 荧光观察 (显微镜镜下观察) 染料选择光路图 取图条件的保存调出取图条件TwinScanner 设定扫描的按钮选择XYZ,

5、XYT或XYL每个通道的调节 共聚焦的孔径大小卤素灯的光强调节 Kalman方式图像显示窗口内存中所显示的文件扫描模式扫描速度像素数缩放和平移 激光输出的调节Lambda扫描的设定物镜聚焦时间间隔和时间计数(用于XYT或XT扫描)扫描带宽选择77获取单张图像（XY平面）（荧光图像）例：绿色荧光染色（FITC）1.点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 2.点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2.3. 点击Apply按钮.(关闭染料选择面板可以用Clo

6、se按钮.)123染料选择后的显示界面88Memo扫描控制面板: 连续扫描: 停止扫描: 快速扫描(隔行扫描)4561 探测器的灵敏度调节 (HV)2 共聚焦的孔径大小调节 (C.A.)3 激光输出的调节 (Laser) 123调节方法 (例: HV调节):点击滑块, HV直接提高 (或降低) 到指定的位置.点击此按钮 或者使用鼠标转轮进行微调.图像调节略述4. 点击XY Repeat按钮开始扫描.5. 调节绿色(FITC)图像.(图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1.)6. 点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo.)99789107. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.*

7、随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 8. 点击XY按钮取得一幅图像.9. 点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现.10. 保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.)MemoFV10-ASW专用的图形格式OIF格式:创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.OIB格式:创建单个的OIF格式的文件,

8、 方便进行移动和进行其它的操作. 1010123获取单张图像（XY平面）（荧光图像） 例：绿色荧光（ Alexa 488 ）红色荧光（ Alexa 546 ）二重染色同步扫描1.点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 2.点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2.3. 点击Apply按钮.(关闭染料选择面板可以用Close按钮.)染料选择后的显示界面1111456Memo扫描控制面板: 连续扫描: 停止扫描: 快速扫描(隔行扫描)1 探测器的灵敏度调节

9、 (HV)2 共聚焦的孔径大小调节 (C.A.)3 激光输出的调节 (Laser) 123调节方法 (例: HV调节):点击滑块, HV直接提高 (或降低) 到指定的位置.点击此按钮 或者使用鼠标转轮进行微调.图像调节略述4. 点击XY Repeat按钮开始扫描.5. 调节绿色(Alexa Fluor 488)图像和红色 (Alexa Fluor 546)图像. (图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1.)6. 点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo.)1212789107. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.

10、(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 8. 点击XY按钮取得一幅图像.9. 点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现.10. 保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.)MemoFV10-ASW专用的图形格式OIF格式:创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.OIB格式:创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作. 1313123获取单张图像（X

11、Y平面）（荧光图像） 例：绿色荧光（ Alexa 488 ）红色荧光（ Alexa 546 ）二重染色序列扫描 (这里介绍线序列扫描.)1.点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 2.点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2.3. 点击Apply按钮.(关闭染料选择面板可以用Close按钮.)染料选择后的显示界面141445674. 点击序列扫描,并选择线序列方式.5. 点击XY Repeat按钮开始扫描.6. 调节绿色(Alexa Fluor 488

12、)图像和红色 (Alexa Fluor 546)图像. (图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1.)7. 点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo.)1 探测器的灵敏度调节 (HV)2 共聚焦的孔径大小调节 (C.A.)3 激光输出的调节 (Laser) 123调节方法 (例: HV调节):点击滑块, HV直接提高 (或降低) 到指定的位置.点击此按钮 或者使用鼠标转轮进行微调.图像调节略述15158910118. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的

13、信息，参照附录2.) 9. 点击XY按钮取得一幅图像.10. 点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现.11. 保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.)MemoFV10-ASW专用的图形格式OIF格式:创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.OIB格式:创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作. 16161234获取单张图像（XY平面）（荧光图像微分干涉） 例：绿色荧光（FITC）+DI

14、C图像1. 点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 2.点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2.3. 点击Apply按钮. (关闭染料选择面板可以用Close按钮.)4. 选择TD1.染料选择后的显示界面1717567Memo扫描控制面板: 连续扫描: 停止扫描: 快速扫描(隔行扫描)1 探测器的灵敏度调节 (HV)2 共聚焦的孔径大小调节 (C.A.)3 激光输出的调节 (Laser) 123调节方法 (例: HV调节):点击滑块, HV直接提高

15、(或降低) 到指定的位置.点击此按钮 或者使用鼠标转轮进行微调.图像调节略述5. 点击XY Repeat按钮开始扫描. 6. 调节绿色 (FITC)图像和微分干涉差的图像.(图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1.)7. 点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo.)18188910118. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 9. 点击XY按钮取得一幅图像.10. 点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImag

16、e(x)” 2D界面就出现.11. 保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.)MemoFV10-ASW专用的图形格式OIF格式:创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.OIB格式:创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作. 19191458Memo 和 按钮: 点击移动1.0m.: 点击移动0.1m.267 获取3D图像(XYZ) (荧光图像) 例: 绿色荧光(FITC)和红色荧光 (Rhodamine)双标这里介绍线序列扫描取图的过程.1

17、. 采用13和14页步骤1到7.2. 输入StepSize大小(点击OP按钮可以使用推荐的值), 并选择 .3. 点击XY Repeat按钮开始扫描.4. 点击 和 按钮上移焦点位置. (参照Memo.)5. 当图像显示到达上限时, 点击Set 按钮确定.6. 点击 和 按钮下移焦点位置. (参照Memo.)7. 当图像显示到达下限时, 点击Set 按钮确定.8. 点击Stop按钮停止扫描.确定Z轴的上限和下限如下.20209101113129. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulat

18、ion方式. 更多的信息，参照附录2.) 10. 选择Depth按钮.11. 点击XYZ按钮取得图像.12. 点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现.13. 保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.)MemoFV10-ASW专用的图形格式OIF格式:创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.OIB格式:创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作. 2121123*可以通过调用扫描状态来实现该

19、设置. 更多的信息, 参照附录5. 获取光谱图像 (XYL) 例: 绿色荧光(Alexa Fluor 488)和绿色荧光 (YOYO-1)双标1. 点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 2. 点击按钮 检查光路.3. 做如下设置.选择 BS20/80 或 DM405/488.选择488nm作为激发光源.选择 Mirror.只选择CHS1.2222456794. 点击按钮 , 出现光谱设置窗口.5. 设置CHS1光谱带宽为10 nm, 以此 为例.(参照附录4关于改变光谱带宽的方法.) 6. 点击XY Repeat按钮开始扫描.7. 在观察图像的

20、同时, 移动光谱带到图像最亮的位置状态.(参照附录4关于改变光谱带宽的方法.)注:移动光谱带位置要保持光谱 带宽为10 nm不变.8. 调节图像.(参照附录1.) 9. 点击Stop按钮停止扫描.232310111213151410. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 11. 设定要扫描的波长范围, 光谱带宽 和步距.Start = 开始波长End = 结束波长Resolution = 光谱带宽StepSize = 步距12. 选择Lamb

21、da按钮.13. 点击XYL按钮取得图像.14. 点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现.15. 保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“oib” 和oif类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.)24241. 双击资源管理器中要选择打开的文件. 1显示状态的切换1:1显示帧的播放选择结束帧投影的切换3D重建放大调整窗口的大小动画播放速度选择开始帧文本不同形状的ROI区域网格箭头比例尺点颜色条Ch1 displayCh2 display 点击按钮 转换显示模式2525121. 点击按钮 并选择 .

22、2. 要保存此图像, 右击此图像, 选择Save Display并命名.2626123451. 点击按钮 .2. 点击图像的同时, 拖放此比例尺到一个特定的位置.3. 点击手柄的左端或右端, 移动鼠标.4. 选择比例尺并右击选择属性的设置.5. 设置具体的比例尺属性.改变比例尺的大小改变文本, 颜色, 字体等.2727以一定的角度观察3D图像观察3D图像的某个横截面13451. 点击按钮 .2. 创建3D图像.3. 拖动鼠标以一定的角度观察图像. 要保存此图像, 进行下一页第6步的 操作. 4. 点击按钮 并选定 .5. 拖动鼠标观察某个垂直横断面. 要保存此图像, 进行下一页第6步的 操作.

23、2828保存上一页中第3、5选项的图像686. 点击按钮 .7. 会创建一个2D图像 (带文件名).8. 保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.)MemoFV10-ASW专用的图形格式OIF格式:创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割.OIB格式:创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作. 292913动画的播放41. 点击按钮 .2. 创建3D图像.3. 拖动鼠标以一定的角度观察图像.4. 点击并控制按钮 实现图像围绕着 X-轴旋转.再

24、次点击停止旋转.点击并控制按钮 实现图像围绕着 Y-轴旋转.再次点击停止旋转.点击并控制按钮 实现图像围绕着 Z-轴旋转.再次点击停止旋转.3030要保存动态旋转的图像, 请参照 如下的方法创建3D图像.例, 试图旋转图像180度. 57106895. 点击按钮 .6. 点击Angle rotation菜单.7. 选择旋转轴.8. 输入旋转的角度.9. 选择AVI类型并点击Create按钮. 10. 输入一个文件名并点击Save按钮.Start =开始角度End =结束角度Frame/s = 旋转速度Interval = 单次旋转的角度3131234基于XYL图像中类似荧光光谱相连的原则, 通

25、过已知的每种荧光染料的定位分解光谱并得到图像.例:绿色荧光(Alexa Fluor 488)和绿色荧光 (YOYO-1)双标56Unmixed image此处显示分解光谱的通道分配1. 打开一幅 Alexa Fluor 488和 YOYO1双标的XYL图像.2. 分别为 Alexa Fluor 488和 YOYO1选定一个封闭的区域.3. 从Processing下拉菜单中选择 Spectral Deconvolution图标.4. 双击ROI1和ROI2区域.5. 检查处理类型设置为 “Normal”并且 点击Execute按钮.6. 获得图像.323223456记载的荧光光谱在此显示.从单标

26、记的XYL图像中取出单个荧光光谱作为参照, 进行光谱的分解并得到图像.例:绿色荧光(Alexa Fluor 488)和绿色荧光 (YOYO-1)双标1. 打开一幅 Alexa Fluor 488单标取样 的XYL图像.2. 为 Alexa Fluor 488选定一个封闭的 区域.3. 从Processing下拉菜单中选择 Spectral Deconvolution图标.4. 双击ROI1区域.5. 点击Save Profile图标.6. 输入保存的名字并且点击OK按钮将 Alexa Fluor 488的光谱记载到数据库中.7. 对于YOYO1单标, 重复1-6步.3333Unmixed im

27、age91011128此处显示分解光谱的通道分配8. 打开一幅 Alexa Fluor 488和 YOYO1双标的XYL图像.9. 从Processing下拉菜单中选择 Spectral Deconvolution图标.10. 双击数据库中记载的 Alexa Fluor 488 和 YOYO1图标.11. 检查处理类型设置为 “Normal”并且 点击Execute按钮.12. 获得图像.34342345基于XYL图像中类似荧光光谱相连的原则, 通过已知的一定数量的荧光标记分解光谱并得到图像.例: 两种类型荧光标记的样品Unmixed image此处显示分解光谱的通道分配1. 打开一幅具有两种

28、类型荧光标记的XYL图像.2. 从Processing下拉菜单中选择 Spectral Deconvolution图标.3. 选中两个检查框用于计算.(具有三种类型荧光标记时要选中 三个检查框.)4. 检查处理类型设置为 “Blind”并且 点击Execute按钮.5. 获得图像. 3535XY或者XYZ图像的每个通道存为 TIFF格式的文件1. 右击图像管理器中显示的图像图标, 选择另存为保存该幅图像.2. 设置Save as类型为 TIFF并保存.* 存为BMP 和 JPEG格式也可以.12312*XY或者XYZ通道合并的图像存为 TIFF格式的文件带有比例尺的图像存为BMP格式的文件1.

29、 右击图像管理器中显示的图像图标, 选择另存为保存该幅图像.2. 设置Save as类型为 TIFF并保存.3. 检查要合并的通道并保存.* 存为BMP 和 JPEG格式也可以.1. 右击该幅图像.2. 选择Save Display并以新的文件名 保存该幅图像.动态图像存为AVI格式的文件1. 右击该图像.2. 选择Save as AVI并以新的文件名 保存该图像.36362345761. 插入一张CD-R光盘.2. 点击OK.3. 选择文件并拖放到CD-R的窗口.4. 点击Write these files to CD.5. 点击Next.6. 开始刻录.7. 点击Finish按钮结束.37

30、3713421. 选择File/Exit, 退出FV10-ASW软件.2. 退出Windows XP.(1) 选择Start/Shut Down. (2) 在Shut Down窗口中,选择Shut Down并点击OK按钮.3. 关闭激光器.(关闭钥匙开关.)3-1. 多线氩离子 (458 nm, 488 nm, 514 nm) OFF (等待风扇停止,关闭电源开关.)3-2. 氦氖绿 (543 nm) OFF3-3. 氦氖红 (633 nm) OFF4. 关闭汞灯电源.3838激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜FV1000- 光谱扫描型光谱扫描型 -(倒置显微镜倒置显微镜IX81)附录附录393

31、9 共聚焦的原理和调节原理HV: 探测器灵敏度的调节 (Voltage)给定值 灵敏度 图像亮度 (注意背景噪音变得突出.)* 推荐值为700V或700V以下. 按钮: 改变电压以1V为一个单位 (投射光通道设定为1V)Gain调节 (x)给定值 图像亮度 依照放大率的变化, 图像变得更亮. 按钮: 改变增益以x 0.01为一个单位 Offset调节 (%)给定值 图像亮度 按钮: 改变增益补偿以1%为一个单位C.A.: 共聚焦孔径大小的调节 (m)给定值 C.A. 大小 图像亮度 (注意光学切片的厚度变大.)* 推荐使用Auto设置.经过调节C.A.要恢复初始值, 再次点击Auto. 按钮:

32、 改变孔径大小以1m为一个单位.M_Ar or HeNeG, HeNeR:激光输出强度的调节 (%)给定值 输出强度 图像亮度 (注意荧光漂白变得明显.)* 激光输出强度尽量要小. 按钮: 改变输出强度以1%为一个单位.Memo共聚焦孔径大小、光学切片厚度和图像亮度的关系C.A.Optical slicethicknessImagebrightnessM_ArPMTImagebrightness激光输出强度、探测器灵敏度和图像亮度的关系4040 获取图像如何降低背景噪音 降低扫描速度通过降低扫描速度探测器从开始检测就 忽略背景噪音.优点:相比Kalman方式, 能够取到更锐的图.缺点:单次扫描的速度很慢.1. 选择扫描速度.*Auto ON:扫描速度变慢时, 背景噪音被去除而图像亮度不变.Auto OFF: 扫描速度变慢时, 背景噪音被去除而图像亮度增加.Kalman方式通过重复获取一定数量的图像进行平均算法运算处理. 从而去除背景噪音和粗糙度.优点:单次扫描的速度很快.缺点:由于图像平均而图像模糊.1. 点击Kalman并选择Line或Frame方式.2. 输入累计数字(扫描的次数).