第六章-荧光光谱法.课件.ppt
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- 第六 荧光 光谱 课件
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1、第六章第六章 荧光光谱法荧光光谱法123分析方法分析方法荧光分光光度计荧光分光光度计基本原理基本原理4应用与示例应用与示例 要求要求掌握基本原理掌握基本原理熟悉仪器基本构造熟悉仪器基本构造了解定量方法了解定量方法FL 物质物质分子分子/原子吸收原子吸收光子能量被激发,然后从激光子能量被激发,然后从激发态发态最低最低振动能级返回到基态振动能级返回到基态时所发射出的光时所发射出的光Fluorescence根据物质的荧光谱线位置(波长)及强度进行根据物质的荧光谱线位置(波长)及强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法物质鉴定和物质含量测定的方法Fluorometry有些物质的分子在用紫外有些物质的分子在
2、用紫外-可见光激发时,能发可见光激发时,能发射荧光,由此建立的分析方法射荧光,由此建立的分析方法Molecular Fluorometry61. 灵敏度非常高:检出限可达灵敏度非常高:检出限可达10-1010-12g/ml2. 选择性好选择性好优点优点 基本原理基本原理分子荧光的产生分子荧光的产生荧光光谱的特征荧光光谱的特征影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素8 1. 分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程2. 荧光的产生荧光的产生分子荧光的产生分子荧光的产生基本原理基本原理基态基态单重态单重态单重态单重态三重态三重态(triplet state)(singlet state)激发态
3、激发态M=2S+1=1(S=0)M=2S+1=3(S=1)禁阻跃迁禁阻跃迁1. 分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程基本原理基本原理10光致发光的分子能级示意图光致发光的分子能级示意图各个不同各个不同振振-转能级转能级基本原理基本原理11 辐射跃迁和无辐射跃迁(热能形式)辐射跃迁和无辐射跃迁(热能形式)电子:激发态电子:激发态 基态基态2. 荧光的产生荧光的产生振动弛豫振动弛豫内部能量交换内部能量交换荧光的发射(荧光的发射(辐射辐射)外部能量交换外部能量交换体系间交叉跃迁体系间交叉跃迁磷光的发射(磷光的发射(辐射辐射)基本原理基本原理1. 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱2.
4、荧光光谱特征荧光光谱特征荧光的光谱特征荧光的光谱特征基本原理基本原理 荧光:荧光:先激发先激发后发射后发射发射发射光谱光谱激发激发光谱光谱不同激发不同激发波长引起波长引起某一波长某一波长荧光发射荧光发射相对效率相对效率固定发射波长固定发射波长扫描激发波长扫描激发波长固定激发波长固定激发波长扫描发射波长扫描发射波长发射荧发射荧光中各光中各波长相波长相对强度对强度1. 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱(excitation spectrum and emission spectrum)基本原理基本原理14激发激发、荧光荧光图形图形激发光谱激发光谱变变不变不变Fex图图发射光谱发射光谱不变不变变
5、变Fem图图作用:作用:1. 鉴别荧光物质鉴别荧光物质2. 选择适当测定波长选择适当测定波长基本原理基本原理15激发光谱及荧光光谱激发光谱及荧光光谱A-激发光谱;激发光谱;F-荧光光谱荧光光谱基本原理基本原理16斯托克斯位移斯托克斯位移荧光光谱形状与荧光光谱形状与ex无关无关荧光光谱与激发光谱互为镜像荧光光谱与激发光谱互为镜像2. 荧光光谱特征荧光光谱特征基本原理基本原理17 溶液荧光光谱中,荧光(发射)光谱波长总大于溶液荧光光谱中,荧光(发射)光谱波长总大于激发光谱波长的现象激发光谱波长的现象 说明在激发与发射之间存在能量损失说明在激发与发射之间存在能量损失 1)斯托克斯位移()斯托克斯位移
6、(Stokes shift, 1852年)年)振动弛豫振动弛豫内部转换内部转换基本原理基本原理18 内转换和振动弛豫使振动激发态电子快速降至内转换和振动弛豫使振动激发态电子快速降至S1*的最低振动能级的最低振动能级荧光发射光谱只有一个发射带荧光发射光谱只有一个发射带 荧光发射通常发生于荧光发射通常发生于S1*最低振动能级,与激发至最低振动能级,与激发至哪一个电子激发态无关哪一个电子激发态无关荧光光谱形态与荧光光谱形态与ex无关无关2)荧光光谱形状与)荧光光谱形状与ex无关无关基本原理基本原理19 电子基态振动能级分布与激发态相似电子基态振动能级分布与激发态相似 E相同相同 小峰间小峰间与振动与
7、振动E有关,强度与跃迁几率有关有关,强度与跃迁几率有关3)荧光光谱与激发光谱互为镜像)荧光光谱与激发光谱互为镜像基本原理基本原理20蒽的能级跃迁蒽的能级跃迁基本原理基本原理21蒽的激发光谱及荧光光谱蒽的激发光谱及荧光光谱S0S2*基本原理基本原理22 1. 荧光产生的条件荧光产生的条件2. 影响荧光强度的结构因素影响荧光强度的结构因素3. 影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素基本原理基本原理231)荧光寿命()荧光寿命(fluorescence life time) 1. 荧光产生的条件荧光产生的条件 除去激发光源后,分子荧光强度降低到激发时最除去激
8、发光源后,分子荧光强度降低到激发时最大荧光强度的大荧光强度的1/e(37%)所需的时间)所需的时间 常用常用f表示表示 荧光物质重要的发光参数之一荧光物质重要的发光参数之一 f的计算的计算-作图法(作图法(p135)基本原理基本原理24 激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比,常用激发光的光子数之比,常用f表示:表示: f :01 f 大大有荧光发射有荧光发射2)荧光效率)荧光效率 (fluorescence efficiency) 基本原理基本原理吸收激发光的光子数发射荧光的光子数f25 例如例如:荧光素钠在水中荧光素钠在水中f =
9、0.92荧光素在水中荧光素在水中f =0.65蒽在乙醇中蒽在乙醇中f =0.30菲在乙醇中菲在乙醇中f =0.10基本原理基本原理26 3)产生荧光的条件)产生荧光的条件 分子必须有强分子必须有强UV-Vis吸收吸收有一定的荧光效率有一定的荧光效率能量以无辐射跃迁形式释放(内转换能量以无辐射跃迁形式释放(内转换与外转换的速度很快)与外转换的速度很快) 无无荧光发射荧光发射否否则则基本原理基本原理271)跃迁类型)跃迁类型2)共轭效应(长共轭结构)共轭效应(长共轭结构)3)刚性结构与共平面性效应)刚性结构与共平面性效应4)取代基效应)取代基效应2. 影响荧光强度的结构因素影响荧光强度的结构因素(
10、内部因素)(内部因素)基本原理基本原理28 分子结构中存在共轭的分子结构中存在共轭的*跃迁,也就是跃迁,也就是K带带强吸收时,才可能有荧光发生强吸收时,才可能有荧光发生 1)跃迁类型)跃迁类型基本原理基本原理29 电子共轭程度电子共轭程度 :荧光强度(荧光效率)荧光强度(荧光效率) 、荧光波长、荧光波长 (长移)(长移)eg: 苯苯 萘萘 蒽蒽ex(nm) 205 268 356em(nm) 278 321 404 f 0.11 0.29 0.362)共轭效应(长共轭结构)共轭效应(长共轭结构) 基本原理基本原理30 同样的长共轭分子:同样的长共轭分子:分子刚性和共平面性分子刚性和共平面性 ,
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