基因表达分析技术课件.ppt

1、A1 基因表达分析技术基因表达分析技术METHODS FOR ANALYZING GENE EXPRESSIONA2基因表达A3一、通过检测一、通过检测mRNA揭示基因转录水平的表达特征揭示基因转录水平的表达特征根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为:封闭性系统研究方法封闭性系统研究方法: 例如例如DNA微阵列、微阵列、Northern印迹、实印迹、实时时RT-PCR等方法。只能研究已知的基因。等方法。只能研究已知的基因。开放性系统研究方法开放性系统研究方法: 如差异显示如差异显示PCR、双向基因表达指纹、双向基因表达指纹图谱、分子

2、索引法、随机引物图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可以发现指纹分析等，可以发现和分析未知的基因。和分析未知的基因。这里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介绍。这里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介绍。A4（一）基于杂交原理检测（一）基于杂交原理检测mRNAmRNA的表达水平的表达水平1Northern 印迹印迹（Northern blot）是一种基于是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种杂交原理建立的一种RNA分析技术分析技术指将指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定交反应来鉴定其中特定mR

3、NA分子的含量及其大小。分子的含量及其大小。A5三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较A6RNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization28S18SA7分子杂交实验分子杂交实验A8放放射射自自显显影影照照片片目目 录录A92核糖核酸酶保护实验核糖核酸酶保护实验（ribonuclease protection assay，RPA）是灵敏度和特异性很高的是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法定量分析方法 基本原理基本原理 是将标记的特异是将标记的特异RNA探针（探针（32P或生物素）与待测或生物素）与待测的的R

4、NA样品液相杂交，标记的特异样品液相杂交，标记的特异RNA探针与目探针与目的的RNA结合，形成双链结合，形成双链RNA，免受，免受RNA酶的消化；酶的消化；而未结合的单链而未结合的单链RNA经经RNA酶酶A或或RNA酶酶T1消化消化形成寡核糖核酸。形成寡核糖核酸。A10RPA基本程序：基本程序：待测待测RNARNA的分离的分离体外转录标记体外转录标记RNARNA探针探针待测待测RNARNA与探针与探针RNARNA进行液相杂交进行液相杂交 RNA酶消化酶消化不同大小杂交片段凝胶电泳分离不同大小杂交片段凝胶电泳分离A11核糖核酸酶保护实验原理示意图核糖核酸酶保护实验原理示意图32P标记的探针：杂交

5、双链进行变性PAGE， 用放射自显影或磷屏成像系统检测探针的信号；生物素标记的探针：杂交双链经过变性PAGE后，电转移至尼龙膜，用链霉亲和素辣根过氧化物酶和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。A12RPA比Northern Blot的优势： 1.过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全 2.RPA比Northern Blot灵敏15150倍，适合检测各种表达水平之基因 3.RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达 4.一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度A13可细胞

6、或组织中原位表达的可细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位进行区域定位标记探针特异性地与目标靶标记探针特异性地与目标靶mRNA序列杂交，检测标记序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。可作为定量分析的补充。可作为定量分析的补充。3原位杂交（原位杂交（in situ hybridization，ISH）A14原位杂交技术主要步骤：原位杂交技术主要步骤： 材料处理及细胞样品的固定；材料处理及细胞样品的固定； 样品的制备和预处理；样品的制备和预处理； 探针的制备和预杂交；探针的制备和预杂交； 探针及样品的变性；探针及样品的变性；

7、杂交温育；杂交温育； 检测杂交信号，进行结果分析。检测杂交信号，进行结果分析。A15（二）（二）RT-PCR常用的常用的mRNA检测方法检测方法1反转录反转录PCR 可用于可用于mRNA的半定量分析的半定量分析 反转录反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 它以它以mRNA为模板，体外扩增为模板，体外扩增cDNA，再以，再以cDNA为模为模板进行特定基因转录产物的板进行特定基因转录产物的PCR扩增。扩增。RT-PCR技术一技术一般用于般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测待测RNA样品进行半定量分析。样

8、品进行半定量分析。反转录实时定量反转录实时定量PCR A16逆转录酶聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增A17A185 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目 录录A19Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录A20n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶

9、n dNTPsn Mg2+ PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分A21PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CA22实验仪器电泳仪电泳仪A23A24PCR仪仪A25PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点A26实验结果PCR结果。1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）A27A28Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cyc

10、le = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 AmpliconA29常规常规PCR方法的局限性分析：方法的局限性分析： 无法对起始模板准确定量无法对起始模板准确定量,只能对终产物进只能对终产物进行分析行分析 必须在扩增后用电泳方法分析必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而费时费力而且且EB有毒有毒 无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测A30A31非特异性的嵌入荧光染料 （Non-specific DNA bin

11、ding dyes）SYBR Green ISYBR GoldEthidium Bromide A32Extension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatDNA binding dyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllllA33实时实时PCRPCR技术原理技术原理目目 录录A34非特异性的嵌入荧光染料评价 优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计PCR引物 缺点：由于它和模板的结合是非特异性 的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产

12、物结合，不能真实反映目 的基因的扩增情况。A35TaqMan探针 评价 优点：荧光信号强 与其它探针相比设计简单 可用于多通道检测 可用于SNP的检测 缺点：比DNA结合染料价格高A36Ct value and Real-Time Quantitative PCR TheoryPCR扩增过扩增过程中，扩增产物程中，扩增产物荧光信号超过基荧光信号超过基线值（进入指数线值（进入指数增长期）时的循增长期）时的循环数。环数。A37 模板起始浓度越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系Ct值与模板起始浓度的关系值与模板起始浓度的关系 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达 如果

13、模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达A38C o p y N u m b e r v s. Ct - Sta n d a r d C u r v ey = -3 .31 9 2x + 3 9 .77 2R2 = 0 .9 9 6 7051 01 52 02 53 03 54 001234567891 01 1Lo g o f co p y nu m b er (1 0n)Ct绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。A3

14、9A40 3、原位、原位PCR技术技术A41A4216块载玻片及24个0.2ml管的样品block A43A44A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达A45DNA芯片芯片(DNA chip) cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上面积的支持物上 。4、基因芯片分析基因表达谱、基因芯片分析基因表达谱（高通量地分析基因表达高通量地分析基因表达）基因芯片基因芯片(gene chip)A46目目 录录A47二、通过蛋白质检测揭示基因二、通过蛋

15、白质检测揭示基因 翻译水平的表达特征翻译水平的表达特征 Western印迹（印迹（Western blot）是一种免疫印迹技术，是一种免疫印迹技术，其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽多肽分子。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最分子。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常用的方法就是利用常用的方法就是利用Western印迹对细胞或组织的总蛋白质印迹对细胞或组织的总蛋白质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。中的特异蛋白

16、质进行定性和半定量分析。（一）采用特异抗体经（一）采用特异抗体经Western印迹可直接印迹可直接 测定基因编码多肽测定基因编码多肽A48 蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备 SDS-PAGE分离分离 蛋白质转膜蛋白质转膜 特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印迹杂交迹杂交 再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig） 最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取免疫

17、印迹信息免疫印迹信息Western blot基本程序基本程序A49A50A51A52West Blot A53受检标本受检标本+固相载体表面的抗原或抗体起反应固相载体表面的抗原或抗体起反应结合特异抗结合特异抗体（一抗）体（一抗）-酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，“吸附吸附”抗原），再进行酶抗原），再进行酶-底物反应。反应后通过专门的酶底物反应。反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。标仪测定、记录数据。（二）酶联免疫吸附分析（二）酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）A54特点：特点：1、具有特异

18、性；、具有特异性；2、灵敏度很高；、灵敏度很高；3、稳定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查，、稳定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查， 尤尤 其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原；其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原；4、既可以做定性试验也可以做定量分析。、既可以做定性试验也可以做定量分析。 酶联免疫吸附分析酶联免疫吸附分析A55 免疫组织化学（免疫组织化学（immunohistochemistry）是利用是利用标记的特异性抗体通过抗原标记的特异性抗体通过抗原-抗体反应和显色反应，在抗体反应和显色反应，在组织或细胞原位检测特定抗原（即目标蛋白质）的方组织或细胞原位检测特定抗原（

19、即目标蛋白质）的方法，简称为免疫组化实验。近年来由于荧光标记抗体法，简称为免疫组化实验。近年来由于荧光标记抗体的广泛应用，这两种方法又被统称为的广泛应用，这两种方法又被统称为免疫荧光法免疫荧光法。（三）免疫组化实验对组织（三）免疫组化实验对组织/ /细胞细胞 表达的蛋白质进行原位检测表达的蛋白质进行原位检测A56A57人皮肤角化细胞免疫荧光染色人皮肤角化细胞免疫荧光染色A58（immunofluorescence），可应用荧光（倒置）显微镜或），可应用荧光（倒置）显微镜或激光共聚焦显微镜（激光共聚焦显微镜（confocal microscopy）对靶分子进行对靶分子进行定性、定量和定位分析，激

20、光共聚焦显微镜还可进行断层定性、定量和定位分析，激光共聚焦显微镜还可进行断层成像，是在蛋白质水平分析基因表达的直观方法。成像，是在蛋白质水平分析基因表达的直观方法。其中抗体对于蛋白质靶点的特异性、种间交叉反应、检测其中抗体对于蛋白质靶点的特异性、种间交叉反应、检测系统的灵敏性以及细胞或组织的固定类型是该方法的关键系统的灵敏性以及细胞或组织的固定类型是该方法的关键因素。因素。运用双重着色或多重着色程序同时对多个感兴趣的靶分子运用双重着色或多重着色程序同时对多个感兴趣的靶分子进行检测，是一种揭示更多有关细胞群的功能和它们之间进行检测，是一种揭示更多有关细胞群的功能和它们之间相互作用信息的有效方法。

21、相互作用信息的有效方法。免疫组化主要是作为定性、定位的技术，若结合密度计量免疫组化主要是作为定性、定位的技术，若结合密度计量系统、图像分析系统等测量工具也可以得到定量的数据。系统、图像分析系统等测量工具也可以得到定量的数据。A59 流式细胞术（流式细胞术（flow cytometry）在细胞水平分析特定在细胞水平分析特定蛋白质的基本原理也是抗原蛋白质的基本原理也是抗原-抗体反应，它利用抗体反应，它利用荧光标记荧光标记抗体抗体与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，从而根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细从而根据细胞表达特定蛋白质

22、的水平对某种蛋白质阳性细胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。（四）流式细胞术用于分析细胞（四）流式细胞术用于分析细胞 特异表达的蛋白质特异表达的蛋白质A60流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的细胞。细胞。广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达水平的定量分析，广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达水平的定量分析，并能够根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。并能够根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。此外，流式细胞术可以使用多个荧光标记的抗体同时对此外，流式细胞术可以使用多个荧光标记的抗体同时对多个基因产物进行

23、标记和监测，是对细胞进行快速分析、多个基因产物进行标记和监测，是对细胞进行快速分析、分选、特征鉴定的一种有效方法。分选、特征鉴定的一种有效方法。A61是将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆是将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用以识别复杂生物样品溶液中抗体）固定在基片上，用以识别复杂生物样品溶液中的目标多肽；的目标多肽；蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质蛋白质/DNA-蛋白质蛋白质/RNA-蛋白质，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、蛋白质，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子小分子-蛋白质

24、等的相互作用蛋白质等的相互作用（五）蛋白质芯片分析蛋白质表达谱（五）蛋白质芯片分析蛋白质表达谱（高通量地分析基因表达高通量地分析基因表达）蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)A62蛋白质检测芯片包括蛋白质检测芯片包括: : 抗体芯片抗体芯片 抗原芯片抗原芯片 配体芯片等配体芯片等A63 目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多采用双向电泳目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多采用双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 简称简称2-D电泳）结合质谱技术。电泳）结合质谱技术。 原理原理: 根据蛋白质分子的两个属性根据蛋白质分子的两个属性等电点和分子质量等电点和分子质量

25、将蛋白质混合物进行分离。电泳结果经染色后，即可对将蛋白质混合物进行分离。电泳结果经染色后，即可对不同样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可从凝胶中将特不同样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可从凝胶中将特定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用用质谱（质谱（mass spectrum）技术进行定性分析，对差异表达）技术进行定性分析，对差异表达的蛋白质进行鉴定。的蛋白质进行鉴定。 可同时分离数成百上千的蛋白质。可同时分离数成百上千的蛋白质。（六）双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质（六）双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质表达谱的分析和鉴定表达谱的分析和

26、鉴定A64 双双 向向 电电 泳泳 技技 术术Two-dimemsional gel electrophoresis, 2DE技术构成：第一相：IEF 采用丙烯酰胺与不同PH的两性 电介质形成的固定的PH梯度 IEF- PAGE第二相：分子筛凝胶 SDS- PAGE特点：1. 一次分离细胞中几乎所有的蛋白质（以spot形式出现）2. 高灵敏度和高分辨率 用银染条件下，可达10-1510-18 mol水平3. 便于计算机分析处理 电泳分离图谱经扫描输入计算机，可以进行蛋白质定位, 等电点,分子量定量不同条件下的图谱进行比较,建立蛋白质组数据库A65A66A67A68A69质质 谱谱 技技 术术

27、质谱仪质谱仪 进样系统进样系统 离子源离子源 质量分析器质量分析器 离子探测器系统离子探测器系统A70在蛋白质组学研究中常用的质谱仪 电喷雾离子化质谱仪（ESI-MS） 基质辅助的激光解吸离子化飞行时间质谱仪 （MALDI-TOF-MS） 四极杆-TOF质谱仪（Q-TOF）A71质谱技术在蛋白质组研究中的作用 1. 肽质谱和肽的序列分析 2. 翻译后修筛的蛋白质鉴定 N端封闭，磷酸化，糖基化 3. 其它：蛋白质二硫键的定量和定位蛋白质蛋白质相互作用的分析蛋白质其它分子相互作用的分析蛋白质二级结构的分析比较不同条件（正常细胞与异常细胞，不同发育阶段 从中获得单个有价值的蛋白质结构与功能A72标签

28、融合标签融合蛋白沉淀蛋白沉淀实验流程实验流程示意图示意图A73 白质相互作用研究领域里得到极大的推广。GST融合蛋白在经过固定有GST(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST 与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面： 一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用A74（二）酵母双杂交技术的基本原理（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途A75A76电泳迁移率变动测定电泳迁移率变动测定( (electrophoretic mo

29、bility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验或称凝胶迁移变动实验( (gel shift assay)最初用于研究最初用于研究DNA结合蛋白与相应结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究术也被用于研究RNA结合蛋白和特定结合蛋白和特定RNA序列间序列间的相互作用。的相互作用。DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定A77放放射射自自显显影影未结合探

30、针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果示意图A78染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可是目前可以研究体内以研究体内DNA与蛋白质相互作用的与蛋白质相互作用的主要方法。主要方法。（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法A79n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图A80Analysis of DNA:Protein Interactions Antibody-Based ChIPA81Chromatin immunoprecipitation (ChIP) HaloCHIP Systeman Antibody-Free Approach HaloCHIP Systeman Antibody-Free Approach