第七章分子发光分析法(荧光、磷光和化学发光)教材课件.ppt

1、2022年5月31日星期二1第七章第七章第七章第七章第七章第七章 分子发光分分子发光分分子发光分分子发光分分子发光分分子发光分析法析法析法析法析法析法molecularmolecularmolecular luminescenceluminescenceluminescenceanalysisanalysisanalysis 第一节第一节 分子荧光与磷光分子荧光与磷光molecular fluorescence and phosphorescence第二节第二节 分子荧光与磷光分子荧光与磷光分析法分析法molecular fluorescence and phosphorescence ana

2、lysis第三节第三节 化学发光分析法化学发光分析法chemiluminescenceanalysis2022年5月31日星期二2一、一、分子荧光与磷光产生过程分子荧光与磷光产生过程luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱excitation spectrum and fluore-scence spectrum三、荧光的产生与分子结构关系三、荧光的产生与分子结构关系 relation between fluorescence and molecular struct

3、ure四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素factor influenced fluorescence第一节第一节第一节第一节第一节第一节 分子荧光与磷光分子荧光与磷光分子荧光与磷光分子荧光与磷光分子荧光与磷光分子荧光与磷光molecular fluorescence molecular fluorescence molecular fluorescence and phosphorescenceand phosphorescenceand phosphorescence2022年5月31日星期二3一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的

4、产生过程一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程 luminescence process of molecular fluorescence and luminescence process of molecular fluorescence and luminescence process of molecular fluorescence and phosphorescencephosphorescencephosphorescence 由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1. 1. 分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原

5、子能级复杂；分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态基态(S0)激发态激发态(S1、S2、激发态振动能级激发态振动能级) )：吸收特定吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式( (见能级图见能级图) )；速度最快、；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T1 、 T2 ；2022年

6、5月31日星期二42.2.2.2.2.2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度电子激发态的多重度电子激发态的多重度电子激发态的多重度电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1，S S为电子自旋量子数的为电子自旋量子数的代数和代数和(0(0或或1)1)；例如，钠只有一个外层电子，；例如，钠只有一个外层电子，S=1/2S=1/2，因此，因此M=2(1/2)+1=2M=2(1/2)+1=2，所以将产生双重线；若为碱土金属，有两个，所以将产生双重线；若为碱土金属，有两个外层电子，它们可能同一个方向自旋，则外层电子，它们可能同一个方向自旋，则S=1/2+1/2=1S=1/2

7、+1/2=1，M=3M=3，为三重线，或者向相反方向自旋，为三重线，或者向相反方向自旋，S=1/2-1/2=0S=1/2-1/2=0，M=1M=1，为，为单重线。单重线。 平行自旋比成对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定( (洪特规则洪特规则) )，三重态能级比相，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态； 通常用通常用S S和和T T分别表示分别表示单重态和三重态。单重态和三重态。 S0T1 禁阻跃迁；禁阻跃迁；通过其他途径进入通过其他途径进入(见能级图见能级图)；进入的；进入的几率小；几率小； 2022年5月31日星期二52.

8、2.2.2.2.2.激发态激发态激发态激发态激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径基态的能量传递途径基态的能量传递途径基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；发光

9、强度相对大；荧光：荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态；基态；磷光：磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级第一激发三重态的最低振动能级基态；基态；2022年5月31日星期二6S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量l l 2l l 1l l 3 外转换外转换l l 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫2022年5月31日星期二7非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 振动弛豫：同一振动弛豫：同一

10、电子能级内以热能量交换形式由高振动能级电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光

11、或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。系间跨越：不同多重态系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。轨道耦合进行。2022年5月31日星期二8辐射能量传递过程辐射能量传递过程辐射能量传递过程辐射能量传递过程辐射能量传递过程辐射能量传递过程 荧光发射：电子由荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态（基态（ 多为多为 S1 S0跃迁跃迁），），发射波长为发射波长为 l l 2的荧光；的荧光； 10-710 -9 s 。 由图可见

12、，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；长； l l 2 l l 2 l l 1 ； 磷光发射：磷光发射：电子由电子由第一激发三重态的最低振动能级第一激发三重态的最低振动能级基态（基态（ T1 S0跃迁跃迁）；）； 电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁） S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 发光速度很慢：发光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。2022年5月31日星期二9二、激发光谱与荧光二、

13、激发光谱与荧光二、激发光谱与荧光二、激发光谱与荧光二、激发光谱与荧光二、激发光谱与荧光( ( ( ( ( (磷光磷光磷光磷光磷光磷光) ) ) ) ) )光谱光谱光谱光谱光谱光谱 excitation spectrum and excitation spectrum and excitation spectrum and fluorefluorefluore- - -scencescencescence spectrum spectrum spectrum 荧光荧光( (磷光磷光) )：光致发光，必须选择合适的激发光波长，：光致发光，必须选择合适的激发光波长，激发光波长如何选择？激发光波长如何

14、选择？1.1.荧光荧光( (磷光磷光) )的激发光谱曲线的激发光谱曲线 由于分子对光的选择性吸收，不同波长的入射光具有不同由于分子对光的选择性吸收，不同波长的入射光具有不同的激发效率。如果固定荧光（或磷光）的发射波长（即测量的激发效率。如果固定荧光（或磷光）的发射波长（即测量波长波长) )而不断改变激发光（即入射光）的波长而不断改变激发光（即入射光）的波长, ,并记录相应的并记录相应的荧光（或磷光）强度，所得到的发光强度对激发波长的谱图荧光（或磷光）强度，所得到的发光强度对激发波长的谱图称为荧光（或磷光）的激发光谱（图中曲线称为荧光（或磷光）的激发光谱（图中曲线I I）。）。 如果固定激发光的

15、波长和强度而不断改变荧光（或磷光）如果固定激发光的波长和强度而不断改变荧光（或磷光）的测量波长（即发射波长），并记录相应的荧光（或磷光）的测量波长（即发射波长），并记录相应的荧光（或磷光）的强度，所得到的发光强度对发射波长的谱图则为荧光（或的强度，所得到的发光强度对发射波长的谱图则为荧光（或磷光）的发射光谱。磷光）的发射光谱。2022年5月31日星期二102. 2. 2.荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱( ( (或磷光光谱或磷光光谱或磷光光谱或磷光光谱或磷光光谱或磷光光谱) ) ) 固定激发光波长固定激发光波长( (选选最大激发波长最大激发波长), ), 化合物化合物发射的荧光

16、发射的荧光( (或磷光强度或磷光强度) )与发射光波长关系曲线与发射光波长关系曲线( (图中曲线图中曲线II或或III) )。 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱可作为发光物质的鉴别手可作为发光物质的鉴别手段，并可用于定量测定时段，并可用于定量测定时作为选择合适的激发波长作为选择合适的激发波长和测量波长的依据。和测量波长的依据。2022年5月31日星期二11 应该指出，激发光谱曲线与其吸收曲线应该指出，激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但前者是荧光强度与波长的关系可能相同，但前者是荧光强度与波长的关系曲线，后者则是吸光度与波长的关系曲线，曲线，后者则是吸光度与波长的关系曲线，两者在性质上是不

17、相同的。当然激发光谱曲两者在性质上是不相同的。当然激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子数目最多，线的最高处，处于激发态的分子数目最多，这可说明所吸收的光能量也是最多的，自然这可说明所吸收的光能量也是最多的，自然能产生最强的荧光。能产生最强的荧光。2022年5月31日星期二12200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱2022年5月31日星期二133.3.3.3.3.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的

18、关系激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比发射光谱的波长比激发光谱的长，激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。 b. .发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量( (如能级如能级图图l l 2 ,l l 1)，产生不同吸收带，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光低振

19、动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如如l l 2 )。 c. . 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。样）成镜像对称关系。 2022年5月31日星期二14镜像规则的解释镜像规则的解释镜像规则的解释镜像规则的解释镜像规则的解释镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级与第一激发态上的各振动能级分布类似；分布类似； 基态上的基态上的零振动能级与零振动能级与第一激发态的第一激发态的二振动能级之二振动能级之间的跃迁几率间的跃迁几率最大，相反跃最大，相反跃

20、迁也然迁也然。 2022年5月31日星期二15 应用镜像对称规则，可以帮助判别某个应用镜像对称规则，可以帮助判别某个吸收带究竟是属于第一吸收带中的另一振动吸收带究竟是属于第一吸收带中的另一振动带，还是更高电子态的吸收带。根据镜像对带，还是更高电子态的吸收带。根据镜像对称规则，如不是吸收光谱镜像对称的荧光峰称规则，如不是吸收光谱镜像对称的荧光峰出现，表示有散射光或杂质荧光存在。出现，表示有散射光或杂质荧光存在。 诚然，也存在少数偏离镜像对称规则的诚然，也存在少数偏离镜像对称规则的现象，究其原因，或是由于激发态时核的几现象，究其原因，或是由于激发态时核的几何构型与基态时不同，或是由于在激发态时何构

21、型与基态时不同，或是由于在激发态时发生了质子转移反应或形成激发态二聚体（发生了质子转移反应或形成激发态二聚体（或激发态复合物）等原因而引起的。或激发态复合物）等原因而引起的。2022年5月31日星期二16200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱2022年5月31日星期二17三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluore

22、scence and molecular structurerelation between fluorescence and molecular structurerelation between fluorescence and molecular structure 1. 1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（荧光量子产率（ ）：）：吸收的光量子数发射的光量子数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，

23、如外转换过程速度快，不出现荧光发射。，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。2022年5月31日星期二182.2.2.2.2.2.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：）跃迁类型： *的荧光效率高，系间跨越过程的速的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具

24、有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强，如有供电基，使荧光增强，如-OH、-NH2、-OCH3、-NR2等；吸电子基团如等；吸电子基团如-NO2、-COOH等减弱荧光，程度高等减弱荧光，程度高时，无荧光。时，无荧光。2022年5月31日星期二192022年5月31日星期二20（5）取代基的空间障碍对荧光也有影响（一般空）取代基的空间障碍对荧光也有影响（一般空间阻碍导致荧光减弱），立体异构现象对荧光强间阻碍导致荧光减弱）

25、，立体异构现象对荧光强度有显著的影响（一般反式荧光强，顺式弱或无度有显著的影响（一般反式荧光强，顺式弱或无荧光）。荧光）。（6）金属螯合物的荧光）金属螯合物的荧光 除过渡元素的顺磁性原除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不能离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧光。但是，在某些情况下，金属螯合物却产生荧光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的测能产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的测定，主要是由于螯合物中配位体的发光。一般来定，主要是由于螯合

26、物中配位体的发光。一般来说，能产生这类荧光的金属离子具有硬酸型结构，说，能产生这类荧光的金属离子具有硬酸型结构，如如Be、Mg、Al、Zr、Th等。等。2022年5月31日星期二21 四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素 factors affecting fluorescence factors affecting fluorescence factors affecting fluorescence intensityintensityintensity 影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部

27、因素1.1.溶剂的影响溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化（极性大，荧光强）；都将使化合物的荧光发生变化（极性大，荧光强）；2.2.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。率增加。3. 溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；的影响较大，需要严格控制；2022年5月31日星期二224.4.4.4.4.4.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象内滤光作用

28、和自吸现象内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。 内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；2022年5月31日星期二235.5.5.5.5.5.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭，是荧光熄灭的主要原因。它是指处于单重碰撞猝灭，是荧光熄灭

29、的主要原因。它是指处于单重激发态的荧光分子与熄灭剂发生碰撞后，使激发态分子以无激发态的荧光分子与熄灭剂发生碰撞后，使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态，因而产生熄灭作用。荧光熄灭的程辐射跃迁方式回到基态，因而产生熄灭作用。荧光熄灭的程度主要取决于荧光分子与熄灭剂的反应速度和熄灭剂的浓度度主要取决于荧光分子与熄灭剂的反应速度和熄灭剂的浓度，另外碰撞猝灭还与溶液的黏度有关，黏度大、熄灭作用小，另外碰撞猝灭还与溶液的黏度有关，黏度大、熄灭作用小，碰撞熄灭随温度的升高而增加。，碰撞熄灭随温度的升高而增加。 能量转移使荧光猝灭。能量转移使荧光猝灭。 氧的熄灭作用，溶液中的溶解氧常对荧光产生熄灭作氧的熄灭

30、作用，溶液中的溶解氧常对荧光产生熄灭作用。这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激发态的荧光用。这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激发态的荧光物质分子相作用，促进形成顺磁性的三重态荧光分子，即加物质分子相作用，促进形成顺磁性的三重态荧光分子，即加速速系间跨越所致系间跨越所致。2022年5月31日星期二24一、一、 仪器与结构流程仪器与结构流程instrument and general process 二、二、 荧光分析法和应用荧光分析法和应用fluorescence analysis and application三、三、 磷光分析法的应用磷光分析法的应用phosphorescence an

31、alysis and application第二节第二节第二节第二节第二节第二节 分子荧光与磷光分析法分子荧光与磷光分析法分子荧光与磷光分析法分子荧光与磷光分析法分子荧光与磷光分析法分子荧光与磷光分析法molecular fluorescence molecular fluorescence molecular fluorescence and phosphorescence and phosphorescence and phosphorescence analysisanalysisanalysis 2022年5月31日星期二25一、仪器结构流程一、仪器结构流程一、仪器结构流程一、仪器结构

32、流程一、仪器结构流程一、仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：基本流程如图：单色器：选择激发光波长的单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光第一单色器和选择发射光( (测量测量) )波长的第二单色器；波长的第二单色器；光源：氙灯和高压汞灯，染光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器料激光器( (可见与紫外区可见与紫外区) )检测器：光电倍增管检测器：光电倍增管。20

33、22年5月31日星期二26仪仪仪仪仪仪器器器器器器光光光光光光路路路路路路图图图图图图2022年5月31日星期二27仪器框图仪器框图仪器框图仪器框图仪器框图仪器框图该型仪器该型仪器可进行荧可进行荧光、磷光光、磷光和发光分和发光分析；析；2022年5月31日星期二28同步扫描技术同步扫描技术同步扫描技术同步扫描技术同步扫描技术同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差关系，同步扫描可分为固定波长差( (ll) )和固定能量差及可和固定能量差及可变波长三种；变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱，谱同步扫描

34、技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；率； 如图如图。 合适的合适的ll可可减少光谱重叠；减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似 ， 发 射 光 谱 严 重 重 叠 ， 但似 ， 发 射 光 谱 严 重 重 叠 ， 但ll156060nmnm时，只显示时，只显示色色氨酸的特征光谱，实现分别测定。氨酸的特征光谱，实现分别测定。2022年5月31日星期二29可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时

35、变化时的荧可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧( (磷磷) )光光谱图光光谱图2022年5月31日星期二30磷光检测磷光检测磷光检测磷光检测磷光检测磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。荧光发射的同时测量磷光。 测量方法：测量方法：（1 1）通常借助于荧光和磷）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。的装置将荧光隔开。（2 2）采用脉冲光源和可控）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要杜室温测量时，不需要杜瓦瓶（英国化

36、学家、物理学瓦瓶（英国化学家、物理学家杜瓦发明的瓶子）。家杜瓦发明的瓶子）。2022年5月31日星期二31二、荧光分析方法与应用二、荧光分析方法与应用二、荧光分析方法与应用二、荧光分析方法与应用二、荧光分析方法与应用二、荧光分析方法与应用1. 1. 特点特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外- -可见分光光度法高可见分光光度法高2 24 4个数量级；为什么？个数量级；为什么？（光度法（光度法 ，检测大信号的微小差别，荧光法小背，检测大信号的微小差别，荧光法小背景下的荧光强度）景下的荧光强度） 检测下限：检测下限：0.10.10.10.1 g/cmg/cm-3-3 相对灵敏度：相对灵敏度

37、：0.050.05mol/L mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3 3）试样量少）试样量少 缺点：应用范围小缺点：应用范围小。为什么？为什么？IIA0lg2022年5月31日星期二322.2.2.2.2.2.定量依据与方法定量依据与方法定量依据与方法定量依据与方法定量依据与方法定量依据与方法(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律：

38、Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc2022年5月31日星期二33（2 2 2 2 2 2）定量方法）定量方法）定量方法）定量方法）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。强度，在标准曲线上求出浓度。比较法：比较法：

39、 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。，比较。2022年5月31日星期二34例、还原态的例、还原态的NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型或辅酶型或辅酶I还原型）是一种具有高荧光的重要的辅酵还原型）是一种具有高荧光的重要的辅酵素。它在素。它在340 nm有最大吸收，在有最大吸收，在465 nm有最大发有最大发射。由标准射。由标准NADH溶液得到下列荧光强度数据：溶液得到下列荧光强度数据：浓度浓度NADH, M相对强度相对强度浓度浓度NADH, M相对强度相对强度0.10013.00.50059.70.20024.60.60

40、071.20.30037.90.70083.50.40049.00.80095.12022年5月31日星期二35请建立一个校正曲线，并用以估计某未请建立一个校正曲线，并用以估计某未知溶液中的知溶液中的NADH浓度，此溶液的荧光浓度，此溶液的荧光相对强度为相对强度为42.3。解：以荧光相对强度为纵坐标，以解：以荧光相对强度为纵坐标，以NADH之浓度为横坐标，标出以上八个之浓度为横坐标，标出以上八个数据点，以直线相连，即可得到校正曲数据点，以直线相连，即可得到校正曲线如下：线如下：2022年5月31日星期二360.00.10.20.30.40.50.60.70.80.9020406080100相对

41、荧光强度相对荧光强度NADH浓度浓度/M2022年5月31日星期二37该曲线的回归方程为：该曲线的回归方程为：Y = 1.76071 + 116.64286X (r = 0.99978)将未知溶液的相对强度标于校正曲线上，将未知溶液的相对强度标于校正曲线上，可得其对应浓度为可得其对应浓度为0.34 M。或代入回归方。或代入回归方程：程：)(35. 064286.11676071. 13 .4264286.11676071. 1MYXNADH2022年5月31日星期二383.3.3.3.3.3.荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)

42、(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂形成配合物后测量；可测量约与有机试剂形成配合物后测量；可测量约6060多种元素。多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物

43、与有机化合物的分析 见表见表 2022年5月31日星期二392022年5月31日星期二402022年5月31日星期二41三、磷光分析法的应用三、磷光分析法的应用三、磷光分析法的应用三、磷光分析法的应用三、磷光分析法的应用三、磷光分析法的应用1.1.稠环芳烃分析稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表杂环化合物（致癌物质）；见表2.2.农药、生物碱、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱、烟碱、降烟碱、新烟碱、2 2，4-4-D D（一种植物生长激素）（一种植物生长

44、激素）、萘乙酸等分析、萘乙酸等分析 检测限检测限0.01 0.01 g/cmg/cm-3-3 3.3.药物分析和临床分析药物分析和临床分析 见表见表2022年5月31日星期二422022年5月31日星期二43重原子效应：重原子效应：I、Br、Pb等称为重原子。在等称为重原子。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加由因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加由单重态转化为三重态的速度，即加快了系间单重态转化为三重态的速度，即加快了系间跨越的速度。跨越的速度。这就是卤素取代基随原子序数增加而荧光下这就是卤素取代基随原子序数增加而

45、荧光下降的原因。不难理解，由于重原子效应增加降的原因。不难理解，由于重原子效应增加系间跨越的速度，使荧光减弱，磷光则相应系间跨越的速度，使荧光减弱，磷光则相应增强。增强。2022年5月31日星期二442022年5月31日星期二45一、一、基本原理基本原理principle 二、化学发光分析的特点二、化学发光分析的特点characteristics三三 装置与技术装置与技术instrument and technology第三节第三节第三节第三节第三节第三节 化学发光分析法化学发光分析法化学发光分析法化学发光分析法化学发光分析法化学发光分析法chemiluminescenceanalysis20

46、22年5月31日星期二46一、一、一、一、一、一、基本原理基本原理基本原理基本原理基本原理基本原理 principleprincipleprinciple1. 1. 化学发光反应化学发光反应 化学发光不是由光、热、电能所产生的光辐射。在化学化学发光不是由光、热、电能所产生的光辐射。在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。基态时，发射出一定波长的光。 A + B = C + D* D* D + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；

47、（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E = 170300 kJ/mol；位于可见光区；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物萤火虫、海洋发光生物)中，中，称生物发光称生物发光(bioluminescence)。2022年5月31日星期二472.2.化学发光效率化学发光效率激发态产物分子激发态产物分子的化学效率：的化学效率：参加反应分子数参加反应分子数激发态分子数激发态分子数 ce 激发态分子的发激发态分子的发

48、光效率：光效率：激发态分子数激发态分子数产生光子数产生光子数 em 时刻时刻t t 的化学发光强度的化学发光强度( (单位时间发射的光量子数单位时间发射的光量子数) )： tctIddclcl d dc c/ /d dt t 分析物参加反应的速率；分析物参加反应的速率；emcecl参加反应的分子数发射光子的分子数2022年5月31日星期二483.3.化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：对于一级动力学反应： cttcttISttcl0cl0cldddd

49、 dc/dt =Kc； K 为反应速率常数。为反应速率常数。定量依据：定量依据：（1 1）在一定条件下，峰值光在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，在一定条件下，曲线下面积为发光总强度曲线下面积为发光总强度(S)，其其与被与被测物浓度成线性：测物浓度成线性：2022年5月31日星期二494.4.化学发光反应的类型化学发光反应的类型（1 1）气相化学发光反应）气相化学发光反应a. 一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 发射的光谱范围：发射的光谱范围：600875nm，灵敏度灵敏度1ng/

50、cm-3；b.氧原子与氧原子与SO2、NO、CO的发光反应的发光反应 O3 O2 + O （1000 C石英管中进行石英管中进行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2 + h 最大发射波长：最大发射波长：200nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3； 2022年5月31日星期二50 O3 O2 + O （1000 C石英管中进行石英管中进行） NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 发射光谱范围：发射光谱范围：4001400nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3；氧原子与氧原子与CO的发光反应：的发光反应： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 发