核酸的定量测定.课件.ppt

1、核酸的定量测定紫外吸收法紫外吸收法核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳紫外吸收法紫外吸收法 实验原理实验原理 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收吸收UV的性质，其吸收高峰在的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升溶液中含有溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即克原子核酸磷的光吸收值（即A值）值）（表）。测得未知浓度核酸溶液的（表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以值，即可以计算出其中计算出其中RNA或或DNA的含量。该法操作简便，迅

2、的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。速，并对被测样品无损，用量也少。 试剂和器材试剂和器材 试剂：试剂： 钼酸铵过氯酸沉淀剂：钼酸铵过氯酸沉淀剂：取取3.6mL 70%过氯酸和过氯酸和0.25g钼钼酸铵溶于酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，蒸馏水中，即成即成0.25%钼酸铵钼酸铵2.5%过过氯酸溶液。氯酸溶液。 5-6%氨水氨水：用：用25-30%氨水稀氨水稀释释5倍。倍。 材料材料 酵母酵母RNA干粉。干粉。 1.1.准确称取待测核酸样品准确称取待测核酸样品0.5g0.5g，加，加少量少量0.010.01mol/L NaOHmol/L NaOH调成调成糊状糊状, ,再加适量水

3、，用再加适量水，用5-6%5-6%氨水调至氨水调至pH7.0pH7.0，定容至，定容至5050mLmL。2.2.取两支离心管，甲管加入取两支离心管，甲管加入2 2mLmL样品溶液和样品溶液和2 2mLmL蒸馏水，乙管蒸馏水，乙管加入加入2 2mLmL样品溶液和样品溶液和2 2mLmL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置沉淀剂。混匀，在冰浴上放置3030minmin。 3.3.在在3000r/min3000r/min下离心下离心10min10min。从甲、乙两管中分别吸取。从甲、乙两管中分别吸取0.5 0.5 mLmL上清液，用蒸馏水定容至上清液，用蒸馏水定容至5050mLmL。选择厚度为。选择厚度为1c

4、m1cm的的石英石英比色比色杯，杯，在在260nm260nm波长处测定波长处测定A A值值。 4.4.测定测定A280A280的值。求出的值。求出A260/A280.A260/A280.判断判断RNARNA的纯度。的纯度。 RNA=A260/A280=2.0 RNA=A260/A280=2.0操作方法操作方法 二、计算公式二、计算公式 A A260260 RNARNA浓度浓度 = = x Nx N 0.024 x L 0.024 x L 式中，式中， A A260260为甲管稀释液在为甲管稀释液在260260nmnm波长处波长处A A值减去乙管稀释值减去乙管稀释液在液在260260nmnm波长

5、处波长处A A值；值； L L 比色杯的厚度，比色杯的厚度，1 1cmcm； N N 为稀释倍数；为稀释倍数； 0.024 0.024每毫升溶液内含每毫升溶液内含1 1gRNAgRNA的的A A值；值； 1 1mLmL待测样品液中核酸（微克）待测样品液中核酸（微克） 核酸核酸 1 1mLmL待测样品液中制品的毫克数待测样品液中制品的毫克数 在本实验中，在本实验中，1 1mLmL待测液中制品量为待测液中制品量为5050gg。 1. 1. 紫外分光光度计使用前要预热。紫外分光光度计使用前要预热。2. 2. 比色皿应成套使用，注意保护比色皿应成套使用，注意保护, ,不能拿在光面上。不能拿在光面上。3

6、. 3. 离心机使用前必须将离心管平衡，对称放置。调速必须离心机使用前必须将离心管平衡，对称放置。调速必须 从低到高，离心完等转子完全停下后，再打开盖子，然从低到高，离心完等转子完全停下后，再打开盖子，然 后将转速打到最低。后将转速打到最低。注意事项注意事项 是当前核酸研究中最常用的方法。有许多的是当前核酸研究中最常用的方法。有许多的优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳用于大片段用于大片段DNA或或RNA的分离，

7、精度低，但分的分离，精度低，但分离范围广。离范围广。电泳迁移率决定于：电泳迁移率决定于：（1）核酸分子的大小）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比）（迁移率与相对分子质量对数成反比）（2）胶浓度）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用（迁移率与胶浓度成反比，常用0.71%）（3）DNA的构象：的构象：超螺旋线状分子开环状分子超螺旋线状分子开环状分子（4 4）电压）电压 （一般（一般5V/cm,5V/cm,电压与迁移率成正比电压与迁移率成正比) )（5 5）碱基组成（影响不大）碱基组成（影响不大）（6 6）温度（）温度（4 43030都可以，常室温进行）都可以，常室温进行） 琼脂糖凝胶

8、电泳常用于琼脂糖凝胶电泳常用于DNADNA分析；分析分析；分析RNARNA时需加时需加入蛋白质变性剂甲醛。电泳完毕用溴化乙锭入蛋白质变性剂甲醛。电泳完毕用溴化乙锭（0.5g/mL0.5g/mL）染色，用紫外光检测）染色，用紫外光检测琼脂糖电泳用于琼脂糖电泳用于DNA分子量的测定分子量的测定在同一凝胶中加入已知相对分子质量的样品（分子marker) ，在电泳完成后，通过染色，照相，从照片上比较待测样品的DNA片段与标准样品中的已知大小片段，可以推测待测未知DNA片段的分子大小。用于小片段用于小片段DNA的分析的分析相对分子质量小于相对分子质量小于1000bp1000bp的的DNADNA片断片断和

9、和RNARNA的电泳。的电泳。PAGEPAGE中一般不含中一般不含RNaseRNase，用于，用于RNARNA分分析时不会分解样品。析时不会分解样品。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）二、实验原理二、实验原理1.在在酸性环境酸性环境中，定磷试剂中的中，定磷试剂中的钼酸铵钼酸铵以钼以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有当有还原剂还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物还原产物钼蓝。钼蓝。2. 2. 钼蓝最大的光吸收在钼蓝最大的光吸收在650650660nm660nm波长处。当波长处。当使用维生素

10、使用维生素C C为还原剂时，测定的最适范围为为还原剂时，测定的最适范围为1-101-10微克无机磷。微克无机磷。3.3. 测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过氯酸消化成氯酸消化成无机磷无机磷再行测定。再行测定。总磷量总磷量减去未减去未消化样品中测得的消化样品中测得的无机磷量，无机磷量，即得核酸含磷即得核酸含磷量。量。4.4. RNARNA的理论含磷量为的理论含磷量为9.5%9.5%，故由所测的核酸含，故由所测的核酸含磷量可计算出磷量可计算出核酸含量核酸含量。 消化的消化的RNARNA溶液溶液(0.06mg/mL) (0.06mg/mL) ： 取取0.6m

11、g0.6mg酵母酵母RNARNA，加入，加入1.5M H1.5M H2 2SOSO4 4溶液溶液10mL10mL，在沸水浴中加热，在沸水浴中加热10-2010-20分钟，使核酸充分钟，使核酸充分水解后，用于对各组分的鉴定。分水解后，用于对各组分的鉴定。 未消化的未消化的RNARNA溶液溶液(0.06mg/mL) :(0.06mg/mL) : 取取0.6mg0.6mg酵母酵母RNA,RNA,加入蒸馏水加入蒸馏水10mL10mL，55-6555-65度消化半小时。度消化半小时。编号编号1 12 23 34 45 56 67 78 8标准磷溶液标准磷溶液10ug/mL(mL)10ug/mL(mL)0

12、.00 0.00 0.20 0.20 0.40 0.40 0.60 0.60 0.80 0.80 1.00 1.00 0.00 0.00 0.00 0.00 水水( (mLmL) )3.00 3.00 2.80 2.80 2.60 2.60 2.40 2.40 2.20 2.20 2.00 2.00 2.00 2.00 2.002.00定磷试剂定磷试剂3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 消化的消化的RNA(0.06mg/ml)RNA(0.06mg/ml)0.00 0.00

13、 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 1.00 0.00 0.00 未消化的未消化的RNA(0.06mg/ml)RNA(0.06mg/ml)0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1.001.00相当于无机磷量相当于无机磷量( (微克微克) )0.00 0.00 2.00 2.00 4.00 4.00 6.00 6.00 8.00 8.00 10.00 10.00 A AB B2.2.将试管内溶液立即摇匀，于将试管内溶液立

14、即摇匀，于4545恒温水浴内保温恒温水浴内保温30-4530-45分钟。取出冷却至室温，于分钟。取出冷却至室温，于660nm660nm处测定处测定OD(OD(光密度光密度) )值值。 3.3.以以1-61-6号管标准磷含量（微克）为横坐标，光密度为纵号管标准磷含量（微克）为横坐标，光密度为纵坐标，绘出标准曲线。坐标，绘出标准曲线。二、实验原理二、实验原理1.脱氧核糖核酸中的脱氧核糖核酸中的2-脱氧核糖脱氧核糖在酸性环境中与在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生二苯胺试剂一起加热产生蓝色蓝色反应，在反应，在595nm处有最大吸收。处有最大吸收。DNA在在40-400微克范围内，光微克范围内，光密度

15、与密度与DNA的浓度成正比。的浓度成正比。2.在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除度。除DNA外，脱氧木糖，外，脱氧木糖，阿拉伯糖阿拉伯糖（五碳糖（五碳糖）也有同样反应也有同样反应。其它多数糖类，包括核糖在其它多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应内，一般无此反应。2.2.将试管内溶液立即摇匀，于将试管内溶液立即摇匀，于7070恒温水浴内保温恒温水浴内保温50-50-6060分钟。取出冷却至室温，于分钟。取出冷却至室温，于595nm595nm处测定处测定ODOD值。值。 3.3.以以1-61-6号管号管DNADNA含量（微克）为横坐标，光密度为纵

16、坐含量（微克）为横坐标，光密度为纵坐标，绘出标准曲线。标，绘出标准曲线。4.4.根据根据7 7号管测得的号管测得的ODOD值，从标准曲线求出值，从标准曲线求出DNADNA待测液中待测液中的的DNADNA含量。含量。二、实验原理二、实验原理1.当当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖转变成醛类，后者与的核糖转变成醛类，后者与3，5-二羟基甲苯二羟基甲苯（地衣酚）反应，在（地衣酚）反应，在Fe3+或或Cu2+催化下，生成催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大处有最大光吸收。光吸收。2.RNA浓度在浓度在20250g/m

17、l范围内，光吸收与范围内，光吸收与RNA浓度成正比。浓度成正比。 地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNADNA和和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。 试管试管试剂试剂/ml0123456RNA待测溶液待测溶液0.00.00.00.00.00.03.0标准标准RNA溶液溶液(100ug/ml)0.00.61.21.82.43.00蒸馏水蒸馏水3.02.41.81.20.60.00地衣酚地衣酚-Fe3+3.03.03.03.03.03.03.02.2.将试管内溶液立即摇匀，置沸水浴内将试管内溶液立即摇匀，置沸水浴内25-3025-30分钟。取分钟。取出冷却至室温，于出冷却至室温，于670nm670nm处测定处测定ODOD值。值。 3.3.以以0-50-5号管号管RNARNA浓度为横坐标，对应光密度为纵坐标，浓度为横坐标，对应光密度为纵坐标，绘出标准曲线。绘出标准曲线。4.4.根据根据6 6号管测得的号管测得的ODOD值，从标准曲线求出值，从标准曲线求出RNARNA待测液浓待测液浓度。度。