第七章抗原抗体反应及应用教材课件.ppt

1、第七章第七章 抗原抗体反应及应用抗原抗体反应及应用第一节第一节 抗体的制备抗体的制备v多抗（多抗（ployclonal antibody）v单抗（单抗（monoclonal atibody）v抗体库（抗体库（antibody library）v基因工程抗体（基因工程抗体（engineering antibody）v催化抗体（催化抗体（catalytic antibody or abozyme）抗血清：含有特异性抗体的动物血清。抗血清：含有特异性抗体的动物血清。 一、抗血清的制备一、抗血清的制备1、免疫动物、免疫动物 抗原抗原 佐剂佐剂 免疫动物免疫动物2、抗血清的纯化和保存、抗血清的纯化和保存

2、 采血采血 抗血清的纯化抗血清的纯化保存保存3、抗血清的特性鉴定、抗血清的特性鉴定 滴度（滴度（titer） 亲和（合）力亲和（合）力 特异性特异性二、抗体的特性二、抗体的特性1 1 抗原抗原- -抗体反应抗体反应作用力作用力 抗原抗体作用力 非共价键结合非共价键结合 氢键氢键 离子键离子键 范德华力范德华力 疏水键疏水键 Source: Li, Y., Li, H., Smith-Gill, S. J., Mariuzza, R. A., Biochemistry 39, 6296, 2000 http:/www.med.sc.edu:85/chime2/lyso-abfr.htm2 抗体的

3、特性测定抗体的特性测定v滴度（滴度（Titer）是指在给定条件下，结合一定量抗原）是指在给定条件下，结合一定量抗原所需的最大的抗血清稀释倍数。（因方法不同有差所需的最大的抗血清稀释倍数。（因方法不同有差异）异）v特异性（特异性（Specificity） 特异性检测特异性检测/竞争性检测竞争性检测v亲和力（亲和力（Affinity）和亲合力（）和亲合力（Avidity） 亲和力是单个抗原表位与单个抗体结合位点亲和力是单个抗原表位与单个抗体结合位点之间的作用力，反映抗体与抗原表位特异性结合之间的作用力，反映抗体与抗原表位特异性结合强弱的量化指标。强弱的量化指标。AbAgHigh AffinityA

4、bAgLow AffinityCalculation of AffinityAg + Ab Ag-AbKeq = Ag-AbAg . AbApplying the Law of Mass Action: Reversible亲合力（Avidity）p156v多价抗原与抗体结合强度的总体评价多价抗原与抗体结合强度的总体评价 ，反映抗原抗体，反映抗原抗体结合的总体效果。（提高浓度改善抗原抗体亲和性）结合的总体效果。（提高浓度改善抗原抗体亲和性）Keq =104Affinity106Avidity1010Avidity3 影响抗原影响抗原-抗体反应的因素抗体反应的因素v亲和力亲和力v亲合力亲合力v抗

5、原抗体比例抗原抗体比例Ab excessAg excessEquivalence Lattice formationv抗原的物质形式抗原的物质形式v环境条件环境条件 温度、离子浓度等温度、离子浓度等Polyclonal antibodies can form lattices, or large aggregates, that precipitate out of solution.If each antigen molecule contains only a single epitope recognized by a given monoclonal antibody, the ant

6、ibody can link only two molecules of antigen and no precipitate is formed.第二节第二节 抗原抗体反应原理抗原抗体反应原理 抗原抗体反应是非共价的特异性可逆反应。抗原抗体反应是非共价的特异性可逆反应。 体外免疫检测的原理。体外免疫检测的原理。一、抗原抗体反应的热力学与动力学一、抗原抗体反应的热力学与动力学 1 溶液中抗原抗体反应的化学平衡溶液中抗原抗体反应的化学平衡 Ag+Ab=Ag-Ab K = SL /SL= K+/K- p152 K : 平衡常数或内在亲和力。平衡常数或内在亲和力。Kd:解离常数解离常数v达到反应平衡

7、需要的时间较长，但反应进行达到反应平衡需要的时间较长，但反应进行90%很很容易。容易。vK相同并不能说明相同并不能说明K+和和K-的大小。的大小。 K +大时，有利于结合，抗原抗体结合稳定大时，有利于结合，抗原抗体结合稳定 K-大时，大时， 达到平衡点快，结合不稳定达到平衡点快，结合不稳定 。 前者用于标记，后者用于亲和层析。前者用于标记，后者用于亲和层析。抗体结合抗原的特异性抗体结合抗原的特异性v同源抗原（强）同源抗原（强）v异源抗原（弱）异源抗原（弱）v变态抗体（强）变态抗体（强）v抗原末端或表面基团具有免疫优势抗原末端或表面基团具有免疫优势三、抗体与大分子多价抗原的反应三、抗体与大分子多

8、价抗原的反应1 多抗原决定簇多抗原决定簇-大分子抗原特征大分子抗原特征 抗原决定簇（表位）抗原决定簇（表位）-多价抗原多价抗原-表位重叠表位重叠v半抗原为单抗原决定簇半抗原为单抗原决定簇v结合在固体上具有多抗原决定簇的效果结合在固体上具有多抗原决定簇的效果v与液体中的半抗原反应不同与液体中的半抗原反应不同2 抗原抗体的亲和力和亲合力抗原抗体的亲和力和亲合力v亲和力亲和力(affinity)单价抗原与抗体结合的强弱单价抗原与抗体结合的强弱v亲合力亲合力(avidity) 多价抗原与抗体结合强度的总体评价多价抗原与抗体结合强度的总体评价 3 抗体与多价抗原结合的浓度带现象抗体与多价抗原结合的浓度带

9、现象v 抗体与单价抗原结合往往形成可溶性复合物抗体与单价抗原结合往往形成可溶性复合物v抗体与多价抗原可以形成沉淀（条件）抗体与多价抗原可以形成沉淀（条件） 抗原抗体反应时抗原抗体反应时 前带区（抗体过量，沉淀少）前带区（抗体过量，沉淀少） 等带区（抗体抗原适量，大量沉淀）等带区（抗体抗原适量，大量沉淀） 后带区（抗原过量，沉淀少）后带区（抗原过量，沉淀少） 初级反应（未出现沉淀）初级反应（未出现沉淀） 次级反应（出现沉淀）次级反应（出现沉淀）v形成沉淀需要一定时间，另外温度、形成沉淀需要一定时间，另外温度、pH值、离子值、离子强度、补体等强度、补体等v沉淀的形成可以用网络理论解释沉淀的形成可以

10、用网络理论解释4 交叉反应交叉反应 抗体与同源抗原反应，又与异源抗原结合就抗体与同源抗原反应，又与异源抗原结合就产生了交叉反应。同源抗原结合强，异源结合弱。产生了交叉反应。同源抗原结合强，异源结合弱。交叉反应 单个抗体结合位点能与不同的抗原表位发生反单个抗体结合位点能与不同的抗原表位发生反应或者一个抗体能与不同的抗原反应。应或者一个抗体能与不同的抗原反应。 当抗原具有相同或相似的抗原表位时即可发生当抗原具有相同或相似的抗原表位时即可发生交叉反应。交叉反应。Anti-A AbAg AAnti-A AbAg BShared epitopeAnti-A AbAg CSimilar epitopeCr

11、oss reactionsAnti-A AbAg CSimilar epitopeCross reactions第三节 常见免疫分析方法v利用抗原抗体特异性反应特点，对其中之一进行利用抗原抗体特异性反应特点，对其中之一进行定性定量分析的方法。定性定量分析的方法。v特异、灵敏、迅速特点。特异、灵敏、迅速特点。一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（immune precipitation) 沉淀反应：沉淀反应： 可溶性抗原（血清蛋白、细胞裂解液等）与相应抗可溶性抗原（血清蛋白、细胞裂解液等）与相应抗体结合后，在有电解质存在时，比例适当，出现肉眼体结合后，在有电解质存在时，比例适当，出现肉眼可见的沉淀物。可见

12、的沉淀物。 半固体琼脂凝胶为介质。半固体琼脂凝胶为介质。A precipitation curve for a system of one antigen and its antibodiesA zone of antibody excess- precipitation is inhibited and antibody not bound to antigen can be detected in the supernatant; an equivalence zone of maximal precipitation - antibody and antigen form large i

13、nsoluble complexes and neither antibody nor antigen can be detected in the supernatant; a zone of antigen excess - precipitation is inhibited and antigen not bound to antibody can be detected in the supernatant.Precipitation reactions（沉淀反应）（沉淀反应）（soluble) in fluids yield a precipitin curve 前带区（抗体过量，

14、沉淀少）前带区（抗体过量，沉淀少） 等带区（抗体抗原适量，大量沉淀）等带区（抗体抗原适量，大量沉淀） 后带区（抗原过量，沉淀少）后带区（抗原过量，沉淀少）v形成沉淀需要一定时间，另外温度、形成沉淀需要一定时间，另外温度、pH值、值、离子强度、补体等离子强度、补体等1 溶液中的沉淀反应 环状沉淀试验抗血清对照:10 1:20 1:40 1:80 1:160沉淀线抗原在凝胶或琼脂中形成可见的沉淀线在凝胶或琼脂中形成可见的沉淀线2. 两种类型两种类型免疫扩散免疫扩散单向扩散（单向扩散（radial immunodiffusion）双向扩散（双向扩散（double immunodiffusion） 。

15、单向扩散单向扩散(radial immunodiffusion)双向扩散双向扩散(double immunodiffusion)？Single diffusion原理原理: :检测抗原检测抗原单向免疫扩散：单向免疫扩散：Ab+琼脂琼脂制板制板打孔打孔AgNSAgAg加样加样观察观察（含量）（含量）（2 2）双向免疫扩散：）双向免疫扩散：琼脂琼脂AbNS免疫电泳血清免疫电泳鉴定-特异图谱火箭免疫电泳对流免疫电泳（1 1）免疫电泳）免疫电泳原理：电泳后双扩原理：电泳后双扩 应用：血清蛋白种类分析应用：血清蛋白种类分析An antigen preparation (orange) is first

16、electrophoresed, which separates the component antigens on the basis of charge. Antiserum (blue) is then added to troughs on one or both sides of the separated antigens and allowed to diffuse; In time, lines of precipitation (colored arcs) form where specific antibody and antigen interact.Immunoelec

17、trophoresis Combines Electrophoresis and Double ImmunodiffusionRocket diffusionantibody(3)(3)对流免疫电泳：对流免疫电泳：方法和原理：方法和原理：双扩电泳双扩电泳NSAgAbImmunoprecipitation using magnetic bead to precipitate antigen4. 免疫共沉淀免疫共沉淀5. 免疫凝集反应(Agglutination Reactions)v抗体与颗粒抗原结合形成的可见聚集反应。抗体与颗粒抗原结合形成的可见聚集反应。The interaction bet

18、ween antibody and a particulate antigen results in visible clumping called agglutinationHemagglutination (血细胞凝集）血细胞凝集）Is Used in Blood TypingABOABO血型系统特点：血型系统特点：表型表型 基因型基因型 红细胞表面抗原红细胞表面抗原 血清中天然抗体血清中天然抗体 AA/A,A/OA抗抗BBB/B,B/OB抗抗AABA/BA 和和 BOO/OH抗抗A 和和 抗抗BPassive Agglutination Is Useful with Soluble An

19、tigens Agglutination reactions employing synthetic beads can be read rapidly, often within 3 to 5 minutes of mixing the beads with the test sample. can detect small amounts of antibody (concentrations as low as nanograms per milliliter).vDefinition - agglutination test done with a soluble antigen co

20、ated onto a particle+A modification of the agglutination reaction, called agglutination inhibition, provides a highly sensitive assay for small quantities of an antigen.凝集抑制凝集抑制In Agglutination Inhibition, Absence ofAgglutination Is Diagnostic of Antigen（eg. Bacteria )The original home pregnancy tes

21、t kit employed hapten inhibition to determine the presence or absence of human chorionic gonadotropin (HCG人绒毛膜促性腺激素).PregnancyMechanism of home pregnant test kit间接凝集抑制试验:乳胶妊娠试验 v 将待测样品中的抗原与已知抗体作用后，再与将待测样品中的抗原与已知抗体作用后，再与相应抗原相应抗原乳胶颗粒混合。因没有游离抗体的存在，乳胶颗粒混合。因没有游离抗体的存在，乳胶颗粒表面的抗原不能与抗体结合出现凝集现象，乳胶颗粒表面的抗原不能与抗体

22、结合出现凝集现象，即凝集被抑制。孕妇尿液中含即凝集被抑制。孕妇尿液中含HCG，用抗，用抗HCG与之与之结合后，再加结合后，再加HCG乳胶，则不出现凝集现象。乳胶，则不出现凝集现象。 v方法方法 v1、取玻片一张，左侧加生理盐水一滴，右侧加待检尿、取玻片一张，左侧加生理盐水一滴，右侧加待检尿液一滴。液一滴。 v2、两侧各加抗、两侧各加抗HCG（HCG诊断血清）一滴，混匀诊断血清）一滴，混匀2分分钟。钟。 v3、两侧各加、两侧各加HCG乳胶抗原一滴，混匀乳胶抗原一滴，混匀2分钟，观察分钟，观察结果。结果。Agglutination inhibition assays can also be use

23、d to determine whether an individual is using certain types of illegal drugs, such as cocaine or heroin.Agglutination inhibition assays are widely used in clinical laboratories to determine whether an individual has been exposed to certain types of viruses that cause agglutination of red blood cells

24、.二、免疫标记二、免疫标记、放射免疫分析、放射免疫分析 放射免疫测定法（放射免疫测定法（RIA）：）： 131I、125I标记，微量物质测定标记，微量物质测定或放射或放射自显影自显影酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验EIA（Enzyme immunoassay）ELISA （Enzyme-linked immunosorbent assay） 直接法直接法 包被抗体包被抗体-标记抗原标记抗原 包被抗原包被抗原-标记抗体标记抗体ELISA原理：原理： 将已知抗原或抗体吸附于固相载体将已知抗原或抗体吸附于固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面

25、进行，用洗涤液将游离体反应在固相表面进行，用洗涤液将游离成分洗去。成分洗去。间接法间接法 包被抗原包被抗原 - 一抗一抗 - 标记二抗标记二抗夹心法夹心法直接夹心直接夹心 ：包被抗体：包被抗体 - 抗原抗原 - 标记抗体标记抗体 间接夹心：包被抗体间接夹心：包被抗体 - 抗原抗原 - 一抗一抗 - 标记二抗标记二抗Dot-ElISA* *间接法：间接法： 检测抗体检测抗体洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤标本标本观察观察结果结果方法：方法：* *双抗体夹心法：双抗体夹心法： 检测抗原检测抗原Ag底物包被标本洗洗涤涤酶标抗体酶标抗体ELISPOT酶联免疫斑点测定法3 荧光免疫分析膜抗原膜抗原4 亲和标记免

26、疫分析亲和标记免疫分析 生物素生物素-亲和素（链亲和素）亲和力高亲和素（链亲和素）亲和力高 地高辛地高辛-抗体抗体Fig. 3. Northern blotting to detect DjPreb RNA. Lane 1, total RNA of planarians. 28 S and 18 S rRNA bands are indicated. Lane 2, the blot was hybridized with DIG-labeled DjPreb RNA probe. Fig.4. Expression patterns of DjPreb mRNA in D.japonica

27、 juveniles detected by whole-mount in situ hybridization. 三、免疫定位分析三、免疫定位分析 荧光免疫定位荧光免疫定位 酶标记免疫定位酶标记免疫定位 免疫组化免疫组化/免疫印迹免疫印迹蛋白印迹蛋白印迹Western Blotting(a) separated by electrophoresis in PAGE/SDS-PAGE, which separates the components according to their molecular weight; lower molecular weight components mig

28、rate farther than higher molecular weight ones. (b) The gel is removed from the apparatus and applied to a protein-binding sheet of nitrocellulose or nylon and the proteins in the gel are transferred to the sheet by the passage of an electric current. (c) Addition of enzyme-linked antibodies detects

29、 the antigen of interest. (d) The position of the antibodies is visualized by means of an ELISA reaction that generates a highly colored insoluble product that is deposited at the site of the reaction.2001 免疫学信息网 http:/免疫印迹免疫印迹Western Blot覆盖转印覆盖转印硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜（去垢剂）（去垢剂）将分子大小不同的蛋白质分开将分子大小不同的蛋白质分开41 24

30、41 24120120His-Pv重组蛋白表达重组蛋白表达SDS-PAGE分析结果。分析结果。M，marker；1，经过诱导的带有重组，经过诱导的带有重组质粒质粒His-Pv超声后沉淀；超声后沉淀；2，经过诱导的带有重组，经过诱导的带有重组质粒质粒His-Pv超声后上清；超声后上清；3，未经诱导的带重组质，未经诱导的带重组质粒粒His-Pv的菌。的菌。斑马鱼卵无细胞体系中斑马鱼卵无细胞体系中C3和和Bf的的Western blot检测（检测（M：marker；H：人血清；：人血清；Z：斑马鱼卵无细胞体系）：斑马鱼卵无细胞体系）兔抗人兔抗人C3多克隆抗体多克隆抗体和和羊抗人羊抗人Bf多克隆抗体多

31、克隆抗体与人血清与人血清和斑马鱼卵无细胞体系均有反应。和斑马鱼卵无细胞体系均有反应。vWestern blot 结果表明结果表明兔抗人兔抗人C3多克隆抗体多克隆抗体和和羊抗人羊抗人Bf多克隆抗体与多克隆抗体与人血清和斑马鱼卵无细胞体系均有反应人血清和斑马鱼卵无细胞体系均有反应（图（图2-20）。兔抗人）。兔抗人C3抗体与斑马鱼卵无细胞体系形成抗体与斑马鱼卵无细胞体系形成了三条特异性条带，其中一条带对应的分子量约为了三条特异性条带，其中一条带对应的分子量约为185 kD，与人，与人C3的分子量大小相当；此外，还有两条分子量的分子量大小相当；此外，还有两条分子量约为约为115 kD和和70 kD的

32、条带，分别与的条带，分别与C3和和C3的大小相的大小相一致。一致。v斑马鱼卵无细胞体系与羊抗人斑马鱼卵无细胞体系与羊抗人Bf抗体的反应仅产生了一抗体的反应仅产生了一条特异性条带，分子量与人的条特异性条带，分子量与人的Bf很接近，约为很接近，约为93 kD。这一结果说明在斑马鱼卵子中确实存在参与替代途径的这一结果说明在斑马鱼卵子中确实存在参与替代途径的补体成分。补体成分。 Fig. 7 Localization of AmphiTIP30 transcripts in different tissues of adult amphioxus. (A) A micrograph shows the

33、 presence of AmphiTIP30 transcripts in the female amphioxus and predominantly expressed in the ovary. (B and C) A micrograph shows the absence of AmphiTIP30 in control sections. (D) Micrographs show the absence of AmphiTIP30 in the spermary in amphioxus. Scale bars represent 100 lm.Fig. 5. Ectopic d

34、orsal expression of ventral markers and CNS duplication after Smed-BMP and Smed-Smad1 RNAi. (A, D) Smed-eye53 expression in controls. In panel D white arrows indicate the pharynx neural plexus and black arrows indicate the visual cells. After RNAi, the treated animals show ectopic dorsal Smed-eye53

35、expression (arrowheads in panels E and F). Black arrows in panels EF indicate the eyes. Red arrow in panel E points to an extra eye. (GR) Immunostaining of the planarian nervous system with anti-SYNORF1 in control (G, J, M,), Smed-BMP (H, K) and Smed-Smad1 (I, L) RNAi-treated planarians. Control ani

36、mals have a normal ventral CNS (G) and dorsal submuscular plexus (J). Partial nerve cords are formed on the dorsal side of treated animals at the level of the submuscular plexus (arrows in panels K and L).Immunostaining Animals were killed in 2% HCl for 5 min on ice and then fixed in Carnoys solutio

37、n for 2 h at 4 C. anti-SYNORF1, a mouse monoclonal antibody specific for synapsin (Developmental Studies Hybridoma Bank, used at a dilution of 1:25). Goat anti-mouse secondary antibody conjugated to Alexa 488 (Molecular Probes) was used at a 1:400 dilution. Samples were mounted in SlowFade Gold anti

38、fade reagent (Invitrogen). Confocal laser scanning microscopy was performed with a Leica TCS 4D (Leica Lasertechnik, Heidelberg) adapted for an inverted microscope (Leitz DMIRB).四、其他应用v免疫亲和层析免疫亲和层析v生物传感器生物传感器 生物受体生物受体转导系统转导系统信号放大并检测信号放大并检测练习题练习题 概念概念1. 抗血清抗血清 2. 滴度滴度 3. 亲和力亲和力 4.亲合力亲合力简答简答如何制备抗体（过程）？如何制备抗体（过程）？列举抗原抗体的应用实例及原理？列举抗原抗体的应用实例及原理？沉淀（凝集）反应；沉淀（凝集）反应； ELISA、蛋白印迹等、蛋白印迹等