第二章-紫外可见分光光度法.课件.ppt

1、紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法第二章第二章“十一五十一五”国家规划教国家规划教材材学习目标 1. 掌握紫外-可见可见分光光度法的原理； 2. 熟悉紫外-可见可见分光光度计的结构及各部分作用，了解不同类型分光光度计的结构； 3. 了解紫外-可见分光光度法实验条件的选择； 4. 掌握紫外-可见分光光度计的定性定量方法。补充内容补充内容 - - 光的性质光的性质 那么光的本质是什么？那么光的本质是什么？ 光具有波动性，用波长光具有波动性，用波长()()和频率和频率()()表表示；示；光具有粒子性，用能量光具有粒子性，用能量(E)(E)表示表示不同波长不同波长的光具有不同的能量。的光具有不

2、同的能量。 既然太阳光可以色散成各种波长的有色光，既然太阳光可以色散成各种波长的有色光，但为什么平时我们却看不到有色光？但为什么平时我们却看不到有色光？ 把适当颜色的两种光按一定强度比例混合能把适当颜色的两种光按一定强度比例混合能成为白光，这两种颜色的光称为互补光。太阳成为白光，这两种颜色的光称为互补光。太阳光中各种色光两两互为互补，成为白光，所以光中各种色光两两互为互补，成为白光，所以我们看到的太阳光是无色的。我们看到的太阳光是无色的。 互补色光示意图互补色光示意图o 为什么我们看到的物质具有不同的颜色？为什么我们看到的物质具有不同的颜色？这是因为物质选择性吸收了某种颜色的光，这是因为物质选

3、择性吸收了某种颜色的光，而呈显出被吸收光的互补光的颜色。而呈显出被吸收光的互补光的颜色。 如如: CuSO: CuSO4 4溶液选择性地吸收白光中间的溶液选择性地吸收白光中间的黄色黄色光光，故，故CuSOCuSO4 4溶液呈蓝色。溶液呈蓝色。 Fe(SCN)Fe(SCN)6 6 3-3-呈呈血红色血红色，说明其溶液选择，说明其溶液选择性地吸收白光中的青色光。性地吸收白光中的青色光。 如果溶液不吸收白色光，则溶液表现为如果溶液不吸收白色光，则溶液表现为无色透明；如溶液对所有颜色的光全部吸收，无色透明；如溶液对所有颜色的光全部吸收，则溶液呈则溶液呈黑色黑色。物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收

4、3 3、互补色光、互补色光：若两种光按适当的强度比 例混合而成白光，则这两种光称为互 补色光1 1、单色光、单色光：同一波长的光2 2、复合光、复合光：不同波长组成的光引言：什么是紫外-可见分光光度法？ 是根据溶液中物质分子或离子对波长为是根据溶液中物质分子或离子对波长为200-760nm这一这一范围的电磁波（紫外和可见范围的电磁波（紫外和可见光谱）的吸收特特点建立起来的一种定性、光谱）的吸收特特点建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。定量和结构分析方法。主要内容 2.1 2.1 基本原理基本原理 2.2 2.2 紫外紫外- -可可见见分光光度分光光度计计 2.3 2.3 分析分析条条件的件

5、的选择选择 2.1 2.1 紫外紫外- -可可见见分光光度法的分光光度法的应应用用 4.1 4.1 基本原理基本原理 基本原理基本原理透光率和吸光度透光率和吸光度Lambert-BeerLambert-Beer定律定律吸光系数吸光系数吸收光谱吸收光谱光的吸收定律光的吸收定律偏离朗伯偏离朗伯- -比尔定律比尔定律的因素的因素百分吸光系数百分吸光系数摩尔吸光系数摩尔吸光系数 当一束单色光通过均匀的溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，还有一部分被器皿表面反射。设入射光强度为I0,吸收光强度为Ia，透射光强度为It，则：0atIII一、透光率和吸光度一、透光率和吸光度1. 透光率 透射光透射光(

6、I (It t) )占入射光（占入射光（I I0 0）的比例的大小称为透光的比例的大小称为透光率，用率，用T T表示：表示：0tITI 透光率越大，溶液对光的吸收越少；透光率越大，溶液对光的吸收越少；反之，透光率越小，溶液对光的吸收反之，透光率越小，溶液对光的吸收越多。越多。吸光度A 透光率的负对数称为吸光度，用透光率的负对数称为吸光度，用A A表示。表示。A A越大，表示物质的吸光能力越强。越大，表示物质的吸光能力越强。 0lglgtIATI 表示物质对光的吸收程度。表示物质对光的吸收程度。吸光度吸光度A A公式：公式：二、朗伯-比尔定律 分光光度法定量的依据 （一）（一） 光的吸收定律光的

7、吸收定律 当一束平行的单色光通过某一均匀、无散射当一束平行的单色光通过某一均匀、无散射的含有吸光物质的溶液时，在入射光的波长、的含有吸光物质的溶液时，在入射光的波长、强度以及溶液的温度等因素保持不变的情况下，强度以及溶液的温度等因素保持不变的情况下，该溶液的吸光度该溶液的吸光度A A与溶液的浓度与溶液的浓度C C及溶液的厚度及溶液的厚度b b的乘积成正比关系，的乘积成正比关系，称为朗伯称为朗伯- -比尔定律：比尔定律：A b c适用条件：仅适用于适用条件：仅适用于单色光单色光, ,稀溶液稀溶液 吸光度的加合性 溶液中含有多种吸光物质时，若吸光物质之间没有相互作用，则溶液吸光度等于各吸光物质的吸

8、光度之和。 二、二、Lambert-BeerLambert-Beer定律定律（二）（二） 偏离朗伯偏离朗伯- -比尔定律的因素比尔定律的因素 根据朗伯比尔定律根据朗伯比尔定律 A=kbcA=kbc ，如固定液层，如固定液层厚度厚度b b, ,以吸光度对浓度作图时，应得到一条通以吸光度对浓度作图时，应得到一条通过原点的直线。过原点的直线。Ac0Ac0正偏离正偏离负偏离负偏离 但在实际工但在实际工作中，作中，吸光度吸光度与浓度之间的与浓度之间的线性关系常常线性关系常常发生偏离发生偏离（二）（二）偏离偏离Lambert-BeerLambert-Beer定律的原因定律的原因1. 1. 非单色光的影响非

9、单色光的影响 在紫外在紫外- -可见分光光度计中，由于仪器性能的可见分光光度计中，由于仪器性能的限制，得不到单纯的单色光。限制，得不到单纯的单色光。2. 2. 非均相体系的影响非均相体系的影响 当样品溶液中含有颗粒等悬浮杂质时，样品为当样品溶液中含有颗粒等悬浮杂质时，样品为不均匀的体系，光线会出现散射。不均匀的体系，光线会出现散射。3. 3. 非平行入射光引起的偏离非平行入射光引起的偏离 4. 4. 溶液本身发生化学变化的影响溶液本身发生化学变化的影响 溶液中待测组分发生了溶液中待测组分发生了解离、缔合解离、缔合等作用，等作用，造成物质光化学性质改变，偏离了偏离朗伯造成物质光化学性质改变，偏离

10、了偏离朗伯- -比比尔定律。例如，铬酸盐在溶液中有如下平衡：尔定律。例如，铬酸盐在溶液中有如下平衡： 呈橙色，而呈橙色，而 CrO42- 呈黄色，二者对呈黄色，二者对不同波长不同波长 的光线的吸收性能完全不同。的光线的吸收性能完全不同。（二）（二）偏离偏离Lambert-BeerLambert-Beer定律的原因定律的原因 Cr2O72- 离解、缔合、异构等如：如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H+2CrO42- 橙色橙色 黄色黄色 l lnm=350nml lnm=375nm5. 5. 浓度的限制浓度的限制 朗伯朗伯- -比尔定律假定物质分子之间不发生相互作比尔定律假定物质分子

11、之间不发生相互作用，因此用，因此只有稀溶液时才基本符合。只有稀溶液时才基本符合。 浓度较高时，物质分子间会互相影响对方的电浓度较高时，物质分子间会互相影响对方的电荷分布，吸光性能发生改变，必然导致偏离。朗荷分布，吸光性能发生改变，必然导致偏离。朗伯伯- -比尔定律比尔定律（二）（二）偏离偏离Lambert-BeerLambert-Beer定律的原因定律的原因三 吸光系数 吸光系数K物理意义：液层厚度为1cm的单位浓度溶液的吸光度，它表示物质对特定波长光的吸收能力。一个物质在一定条件下的吸光系数为定值。通常有两种表示方法： 吸光系数吸光系数百分吸光系数百分吸光系数摩尔吸光系数摩尔吸光系数 K值的

12、大小取决于吸光物质的性质、入射吸光物质的性质、入射光波长、溶液温度和溶剂性质等光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓度大小和液层厚度无关。但K值大小因溶液浓度所采用的单位的不同而异。 摩尔吸光系数摩尔吸光系数 当溶液的浓度以物质的量浓度（当溶液的浓度以物质的量浓度（molmolL-1L-1）表示，液）表示，液层厚度以厘米（层厚度以厘米（cmcm）表示时，相应的比例常数）表示时，相应的比例常数K K称为摩称为摩尔吸光系数。以尔吸光系数。以表示，其单位为表示，其单位为L Lmol-1mol-1cm-1cm-1。这样，。这样，比尔定律可以改写成比尔定律可以改写成 A=bcA=bc 物理意义：将样品浓

13、度为物理意义：将样品浓度为1mol1molL L-1 -1的溶液置于的溶液置于1cm1cm样品样品池中在一定波长下测得的吸光度值。池中在一定波长下测得的吸光度值。 摩尔吸光系数是摩尔吸光系数是吸光物质的重要参数之一，吸光物质的重要参数之一，它表示物质对某一特定波长光的吸收能力。它表示物质对某一特定波长光的吸收能力。愈愈大，大，表示该物质对某波长光的吸收能力愈强，表示该物质对某波长光的吸收能力愈强，测定的测定的灵敏度也就愈高灵敏度也就愈高。因此，测定时，为了。因此，测定时，为了提高分析的灵敏度，通常选择摩尔吸光系数大提高分析的灵敏度，通常选择摩尔吸光系数大的有色化合物进行测定，选择具有最大的有色

14、化合物进行测定，选择具有最大值的波值的波长作入射光。长作入射光。 （2） 百分吸光系数百分吸光系数 一定波长下，吸光物质的溶液浓度为一定波长下，吸光物质的溶液浓度为1g/100ml(1%)，液层厚度为，液层厚度为1cm时，时， 溶液的吸光度。设吸光物质的摩尔质量为溶液的吸光度。设吸光物质的摩尔质量为 M g/mol ，则：则： 1mol/LM g/1000mlM/101g/100ml 例：将例：将 1.00mg 维生素维生素 B12（摩尔质量（摩尔质量 为为 1355）溶于）溶于 25.00ml 蒸馏水中，用蒸馏水中，用 1.0cm 比色杯，在比色杯，在 361nm 波长下，测波长下，测 得吸

15、光度为得吸光度为 0.400，计算百分吸光系数。，计算百分吸光系数。 三三 吸光系数吸光系数 例：用氯霉素（分子量为例：用氯霉素（分子量为323.15323.15）纯品配制）纯品配制100mL100mL含含2.00mg2.00mg的溶液，使用的溶液，使用1.00cm1.00cm的吸收池，的吸收池，在波长为在波长为278nm278nm处测得其透射率为处测得其透射率为24.3%24.3%，试计，试计算氯霉素算氯霉素278nm278nm波长处的摩尔吸光系数和百分吸波长处的摩尔吸光系数和百分吸光系数。光系数。 解：已知： M=323.15g/mol c=2.0010-3% T=24.3% o 例：已知

16、某化合物的相对分子质量为例：已知某化合物的相对分子质量为251251，将此，将此化合物用乙醇作溶剂配制成浓度为化合物用乙醇作溶剂配制成浓度为0.150mmol0.150mmolL L1 1的溶液，在的溶液，在480nm480nm波长处用波长处用2.00cm2.00cm吸收池测得透吸收池测得透光率为光率为39.839.8，求该化合物在上述条件下的摩尔，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数吸光系数解：由解：由Lambert-BeerLambert-Beer定律可得定律可得 已知c=0.15010-3molL1， b=2.00cm，T=0.398代入311(480)41lg 0.3981.33 10

17、1.50 102.00nmAL molcmcbmol Lcm 吸收光谱曲线吸收光谱曲线又称吸收曲线或吸收光谱，即又称吸收曲线或吸收光谱，即逐渐改变通过某一溶液的入射光的波长，并记下逐渐改变通过某一溶液的入射光的波长，并记下该溶液对每一种波长光的吸收程度（即吸光度该溶液对每一种波长光的吸收程度（即吸光度A A），然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作），然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，所得曲线即称为该溶液的吸收光谱曲线。图，所得曲线即称为该溶液的吸收光谱曲线。 四四 吸收光谱吸收光谱 四四 吸收光谱吸收光谱 由高锰酸钾溶液吸收光谱曲线，我们可得到如由高锰酸钾溶液吸收光谱曲线，我们可得到如下

18、信息：下信息： 高锰酸钾溶液对高锰酸钾溶液对不同波长的光的吸收程不同波长的光的吸收程度是不同的度是不同的，对波长为，对波长为525nm525nm的绿色光吸收最多，的绿色光吸收最多，在吸收曲线上有一高峰（称为在吸收曲线上有一高峰（称为吸收峰吸收峰），而对红色），而对红色光和紫色光吸收很少，几乎能完全透过，因此光和紫色光吸收很少，几乎能完全透过，因此KMnO4KMnO4溶液呈紫红色。光吸收程度最大处的波长称溶液呈紫红色。光吸收程度最大处的波长称为为最大吸收波长最大吸收波长（常以（常以maxmax表示）。在进行光度表示）。在进行光度测定时，通常都是选取在测定时，通常都是选取在maxmax的波长处来测

19、量，的波长处来测量，因为这时可得到最大的测得灵敏度。因为这时可得到最大的测得灵敏度。 不同浓度的高锰酸钾溶液，其吸收曲线的形状相不同浓度的高锰酸钾溶液，其吸收曲线的形状相似，最大吸收波长也一样，不过峰高不相同。不同物质似，最大吸收波长也一样，不过峰高不相同。不同物质的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同。因此，的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同。因此，可利用吸收曲线来作为物质定性分析的依据。可利用吸收曲线来作为物质定性分析的依据。 不同浓度的同一种物质的溶液，若在相同的波长不同浓度的同一种物质的溶液，若在相同的波长处测量，其所测得的吸光度随浓度的增加而增大，吸收处测量，其所测得的吸

20、光度随浓度的增加而增大，吸收峰也随之增高。这便是峰也随之增高。这便是物质定量分析的理论依据物质定量分析的理论依据。 吸光度与被测物质浓度的关系符合朗伯吸光度与被测物质浓度的关系符合朗伯- -比比尔定律，那么如何测量吸光物质的吸光度？应尔定律，那么如何测量吸光物质的吸光度？应该使用该使用紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计来进行测量，其基来进行测量，其基本结构有五部分组成：本结构有五部分组成： 分别为：分别为： 光源光源 单色器单色器 吸收池吸收池 接受器接受器 显示系统显示系统 光源光源单色器单色器比色皿比色皿检测器检测器显示系统显示系统常用光源常用光源光源波长范围(nm)适用于氢灯18

21、5375紫外氘灯185400紫外钨灯3202500可见，近红外卤钨灯2502000紫外，可见，近红外光源光源 ：提供入射光：提供入射光单色器单色器作用作用:产生产生单色光单色光常用的单色器：常用的单色器：棱镜和光栅棱镜和光栅样品池（吸收池、比色皿）样品池（吸收池、比色皿） 厚度厚度(光程光程): 0.5, 1, 2, 3, 5cm 材质：玻璃比色皿可见光区材质：玻璃比色皿可见光区 石英比色皿可见、石英比色皿可见、紫外光区紫外光区检测器检测器 作用：作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器：常用检测器： 光电管光电管 光电倍增管光电倍增管 光二极管阵

22、列光二极管阵列 检流计、微安表，电位计、数字电压表、记录仪、检流计、微安表，电位计、数字电压表、记录仪、示波器及计算机等进行仪器自动控制和结果处理。示波器及计算机等进行仪器自动控制和结果处理。 第三节第三节 分析条件的选择1、显色反应及其条件2、测定波长的选择3、吸光度范围的选择4、参比溶液的选择 微量微量Fe3+Fe3+、Cu2+Cu2+的溶液，如何用可见分的溶液，如何用可见分光光度法进行测量？通过显色反应，使无色光光度法进行测量？通过显色反应，使无色或浅色的溶液转化成有色的溶液，借此进行或浅色的溶液转化成有色的溶液，借此进行测量。测量。 1 1、显色反应及其条件、显色反应及其条件o可见光区

23、的吸光光度法只能用于测定有色可见光区的吸光光度法只能用于测定有色 溶液。溶液。o对无色溶液和颜色较浅的溶液进行测定时，必须将对无色溶液和颜色较浅的溶液进行测定时，必须将被测组分转变成有色化合物被测组分转变成有色化合物( (显色反应显色反应) )。o能与被测组分反应使之生成有色化合物的试剂称为能与被测组分反应使之生成有色化合物的试剂称为显色剂。显色剂。 显色剂必须满足下述条件：显色剂必须满足下述条件： （1 1）灵敏度要高：要求选择的显色剂能与待测组分生）灵敏度要高：要求选择的显色剂能与待测组分生 成成摩尔吸收系数较大摩尔吸收系数较大的有色化合物。的有色化合物。（2 2）选择性要好。）选择性要好

24、。（3 3）有色化合物稳定性好）有色化合物稳定性好 。（4 4）反应定量完成，否则再现性就较差。）反应定量完成，否则再现性就较差。（5 5）有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要足）有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要足 够大，一般要求相差够大，一般要求相差 60 nm 60 nm 以上。以上。显色条件的选择显色条件的选择 1. 1. 显色剂的用量显色剂的用量 2. 2. 溶液的酸度溶液的酸度 3. 3. 显色温度显色温度 4. 4. 显色时间显色时间 1）显色剂的用量）显色剂的用量 吸光度吸光度A与显色剂用量与显色剂用量cR的关系会出现如的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦

25、处。图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。2）溶液酸度溶液酸度 在相同实验条件下，分别测定不同在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的恒定的平坦区所对应的pH范围。范围。ATATAtAt显色反应的干扰及消除二、测定波长的选择选择原则：选择原则：“吸收最大，干扰最小吸收最大，干扰最小”灵敏度 选择最大吸收波长（max ）作为入射波长。 若干扰物质在max处也有强烈吸收时，可选用非最大吸收处的波长，但应尽可能选择A 随波长改变而变化不大的区域内的波长。选择性 3、吸光度范围的选择、吸光度范

26、围的选择控制浓度控制浓度 吸光度吸光度A：0.20.84. 参比液的选择参比液的选择l lmaxl lmaxu灵敏度高：灵敏度高： max在在104105 之间之间u吸光度在吸光度在0.2-0.8之间，误差较小，测定较准确。之间，误差较小，测定较准确。1.1.标准曲线法标准曲线法 n取系列浓度标准溶取系列浓度标准溶液，测定吸光度液，测定吸光度A，作吸光度作吸光度A对溶液对溶液浓度浓度c的图，得过坐的图，得过坐标原点的直线。标原点的直线。n在相同条件下，测在相同条件下，测量被测溶液的吸光量被测溶液的吸光度，在标准曲线上度，在标准曲线上查得溶液浓度。查得溶液浓度。 c = 0.0ug/ml 110

27、-4 210-4 310-4 510-4 710-4 X= 410-4 A = 0.0ug/ml 0.00 0.100 0.196 0.290 0.487 0.682 预先配制一个与待测液浓度相接近的预先配制一个与待测液浓度相接近的标准溶液标准溶液(其浓度用其浓度用cs表示表示)，测得其吸光，测得其吸光度为度为 As，再测定待测液的吸光度，再测定待测液的吸光度Ax，则，则待测液浓度待测液浓度cs可从下式求得可从下式求得 sscAAcxx2 2、比较法（标准对照法）、比较法（标准对照法）二、多组分的测定 对于含有多种被测组分的试液，如果吸光物质之间没有相互作用，且服从 Lambert-Beer定律，此时系统的吸光度等于各组分的吸光度之和。 吸收光谱通常有以下两种情况。 （1）吸收峰互不重叠： （2）吸收峰重叠：吸收峰不重叠 吸收峰重叠2.多组分定量方法多组分定量方法1) 1) 解联立方程组解联立方程组yyxxyxbcbcA111l ll ll l yyxxyxbcbcA222l ll ll l