IVF实验室的基本操作-PPT课件.pptx

1、IVF实验室的基本操作实验室操作原则 防止 污染配子标本的标记；受精、胚胎移植； 两人核对毒性测试；培养液、耗材的使用；实验室的质量控制和管理无误无菌无毒辅助生殖技术基本操作配子、胚胎培养系统1配子的收集和处理2体外受精技术3胚胎培养和移植4胚胎冷冻和解冻5培养液的准备v培养液的基本组分 无机盐离子-维持pHpH和渗透压 碳水化合物-能量来源 蛋白质来源 抗生素v矿物油 有利于维持培养液温度、pHpH值和渗透压稳定 防护屏障, ,减少污染 吸收脂溶性毒素 防止液体蒸发培养液的准备 取卵前一日下午进行v原则: :高效、方便、安全、经济 v四孔培养皿卵v处理精液所需培养液v微滴培养受精卵、胚胎v胚

2、胎移植液37 , 5% 或 6%CO2培箱内 平衡过夜卵母细胞的获取v注射hCGhCG后36-3836-38小时取卵v阴道超声探头引导下经阴道穿刺抽吸卵泡v核对姓名v解剖显微镜下辨认卵冠丘复合物OCCCOCCCv37, 537, 56%CO6%CO2 2 培养 v操作迅速, ,避光精液处理v正常精液: :同IUIIUIv极度少精: :增加离心力v死精症: :低渗肿胀实验v附睾穿刺精子: :v睾丸穿刺或活检精子: : 1ml1ml注射器针头挑碎组织, ,离心悬液v附睾、睾丸精子的冷冻常规受精 取卵后4-8h 习惯症:精液正常, 轻度少、弱精症受精率:6580(MII卵)受精时间:长受精、短受精卵

3、母细胞浆内单精子显微注射v习惯症: :严重少弱精、梗阻性无精、畸精症、既往IVFIVF常规受精失败史、某些不明原因不孕等v时间: :取卵后2 2小时v剥卵: :利用透明质酸酶( (80mIU/ml)80mIU/ml)和机械法剥除颗粒细胞卵母细胞浆内单精子显微注射v卵母细胞成熟度的评价GVMIMII 卵母细胞浆内单精子显微注射v操作滴的准备: :7 7PVP PVP v加精v装针v显微注射 v受精率: :7070受精方式的选择vICSIICSI的安全性？ 逃避了自然选择过程 垂直传递遗传缺陷 操作过程对配子的损伤v严格掌握ICSIICSI习惯症非男性因素不孕ICSI治疗结局非男性因素不孕症,IC

4、SI未显现出优势检查受精v时间: :受精后15151818小时v机械法除去颗粒细胞及放射冠v正常受精: :两个原核, ,两个极体合子形态评价v原核的大小、位置及方向v核仁前体的数目、大小、分布v胞浆的外观v早期卵裂情况异常受精1PN1PNv发生率 1 15 5 卵裂率 74%74% 染色体二倍体率 5 5 囊胚形成率 29% 29% (Noyes 2008)(Noyes 2008)v机制: : 雌雄原核发育不同步 雌雄原核融合 孤雌来源 ICSIICSI多见异常受精多PNv发生率: :IVF 5-8% IVF 5-8% ICSI 1% ICSI 1%v发生机制: : 2 2精子进入 第2 2极

5、体滞留 双倍体卵母细胞未见原核未受精v估计机制 卵母细胞未成熟 卵母细胞染色体异常v卵裂率 10%10% 染色体二倍体率 3%3% 优胚率低 (12/38) (12/38) 囊胚形成 (0/12) (0/12) (Noyes 2008)(Noyes 2008) 受精失败v受精率20% 20% 受精率低下 所有成熟卵均未受精 受精失败v常规受精周期 失败率 1010 精子功能障碍 卵母细胞成熟障碍 补打ICSI?ICSI?vICSIICSI周期 失败率 2 23 3 严重精子畸形 卵母细胞激活 钙离子载体？机械激活？ 胚胎培养胚胎质量评价v胚胎评价标准 细胞数 碎片: :无碎片 碎片10% 50

6、%50% 卵裂球均匀程度 囊胚的评分体系4AA4AA囊胚腔的大小内细胞团细胞分级滋养层分级三位评分法1:1:不到整个胚胎的一半2 :2 :超过了胚胎体积的一半3 :3 :完全占据整个胚胎4:4:扩张囊胚5:5:孵化囊胚 6:6:孵化后囊胚A A包裹紧密, ,大量细胞B B结构松散, ,少量细胞C C极少量细胞A A许多细胞紧密结合B B少量细胞, ,结构松散C C极少量细胞 2AA5AA 4BA4CC胚胎移植操作v选择需要移植的胚胎, ,移入移植滴内 3535岁以下, ,首次移植的病人移植2 2枚胚胎 3535岁以上, ,或非首次移植的病人移植3 3枚胚胎v确认核对患者姓名vD3 or D5

7、D3 or D5 移植？移植液移植液移植液和胚胎气 20l气胚胎移植操作胚胎冷冻v意义: :提高累计妊娠率, ,幸免多胎, ,减少卵巢过度刺激风险v温度的急剧变化形成冰晶 机械性损伤 溶质性损伤 渗透压损伤 核心: :幸免冰晶形成v冷冻方法: :慢冻速融法 玻璃化冷冻法v冷冻保护剂 渗透性保护剂: :EG PRON EG PRON 甘油 非渗透性保护剂: :蔗糖 大分子物质胚胎的冷冻: :慢速冷冻室温 15min室温 5min室温15minPBS1.5M丙二醇1、5M丙二醇0、1M蔗糖慢冻速融法v冷冻程序 2 2007 3/min7 3/min -7 -7 人工植冰 -7-730 030 0、

8、3/min3/min -30 -30120 30/min120 30/min胚胎复苏12340、5M丙二醇0、2M蔗糖 5min0、2M蔗糖 5minPBS 5min1、0M丙二醇 0、2M蔗糖 5min 预防冰晶的再形成 复苏程序: 室温 40s 30水浴 1min胚胎冻融损伤v复苏胚胎评价: :50%50%卵裂球完整 存活 复苏率90%90%v无损伤胚胎着床率高 部分损伤胚胎着床能力下降玻璃化冷冻v原理v条件: :高浓度冷冻保护剂 极快的降温速度v载体: :开放式 密闭式v习惯症: :卵母细胞 囊胚v优点: :复苏率高其他技术-IVM-IVMv未成熟卵母细胞体外成熟( (IVMIVM) )v优点: :简便 经济 幸免OHSSOHSSv体外培养24-48h24-48hvIVMIVM培养液感谢您的聆听！感谢您的聆听！