生物分子的分离纯化课件.ppt
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- 生物 分子 分离 纯化 课件
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1、Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第七章生物分子的分离纯化Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics生物大分子(蛋白质、核酸、糖复合物等)生物分子(Biomolecule)泛指生物体特有的各类分子,是自然存在于生物体中的分子的总称,是组成生命的基本单位。包括小分子(如脂类、激素、维生素等)Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5)能人工合成与改造。生物分子是生物所特有的有机化合物,具有如下主要特征:1)结构复杂有序、具有特殊的层
2、次;2)行使专一的功能;3)代谢是其存在的条件;4)生物分子体系具有自我复制的能力;Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics一、生物大分子的制备 生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics(1)分离纯化方法千差万别,没有一种标准方法可通用于各种生物大分子的分离制备;(2)制备几乎都是在溶液中进行的,难以准确估计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各种组份的综合影响
3、生物大分子的制备有以下主要特点:Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics(3)大多数生物大分子的含量极微,分离纯化的步骤多,流程长,有的目的产物甚至要经过几十步的操作才能达到所需纯度;(4)分离纯化过程中要保证目标产物的活性。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics生物大分子制备的一般步骤:生物大分子制备的一般步骤: 确定制备的目的和要求确定制备的目的和要求文献调研和预备性实验文献调研和预备性实验建立相应的可靠的分析测定方法建立相应的可靠的分析测定方法材料的破碎和预处理材料的破碎和预处理
4、分离纯化方案的选择和探索分离纯化方案的选择和探索产物纯度的鉴定产物纯度的鉴定产物的浓缩,干燥和保存。产物的浓缩,干燥和保存。科研、开发或发现新的物质制备的关键要求达到一维电泳一条带,二维电泳一个点,或HPLC和毛细管电泳都是一个峰最困难的过程掌握目的产物的理化性质特异性强准确度高灵敏度高使用快捷方便 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 制备生物大分子的分离纯化方法多种多样,主要是利用它们之间理化性质的差异。根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型:(1)根据分子极性大小和溶解度的不同,如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级
5、沉淀法等;(2)根据分子形状和大小不同,如凝胶过滤层析等;(3)根据物质吸附性质不同,如选择性吸附与吸附层析法等;(4)根据分子带电性(电离性质)的差异,如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。(5)根据配体特异性,如亲和层析。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics破碎方法应用机械法研磨法细菌、酵母匀浆法机体软组织捣碎法动物韧性组织化学法酶解法细菌、酵母去垢剂组织、细胞有机溶剂细菌、酵母物理法反复冻融法细胞超声波法细胞悬液低渗裂解法红细胞冷热交替法细菌、病毒常用破碎方法常用破碎方法 Zhejiang Provincial Key Lab of
6、 Medical Genetics影响提取效果的因素影响提取效果的因素(1)pH值 (2)盐浓度(即离子强度) (3)温度 (4)水解酶 (5)搅拌与氧化 (6)有机溶剂 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 生物大分子的分离纯化生物大分子的分离纯化 (1)盐析法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics(2)有机溶剂沉淀法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics(3) 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子
7、化合物分开的方法。含蛋白溶液透析袋透析液磁子电磁搅拌器Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics二、核酸的分离纯化 核酸(nucleic acid)是遗传信息的携带者,是基因表达的物质基础(包括DNA与RNA)。 无论是进行核酸结构还是功能研究,首先需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。 DNA与RNA理化性质及细胞定位上的差异决定了两者的最适分离与纯化条件的不同Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics分离纯化的原则 一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清除其它
8、分子的污染,保证核酸制品的纯度。 意义:遗传信息全部储存在一级结构之中,核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics对于核酸的纯化应达到以下三点要求: 1)核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂; 2)其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度; 3)排除其它核酸分子的污染,如提取DNA分子时应去除RNA,提取RNA分子时应去除DNA。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics保持核酸的完
9、整性 在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。 1)温度不要过高(04);(高温破坏氢键) 2)控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破坏磷酸二酯键) 3)保持一定离子强度; 4)减少物理因素对核酸的机械剪切力.Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics核酸制备的技术路核酸制备的技术路线线Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics核酸的浓缩、沉淀与洗涤 随着提取试剂的逐步加入,去除杂质时的丢失,样品中核酸的浓度会逐步下降,当不能满足后续研究与诊断所需时应对样品进行浓缩。 沉
10、淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法, 优点: 改变核酸的溶解缓冲液; 重新调整核酸的浓度; 去除溶液中某些盐离子与杂质。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics核酸的鉴定与保存(一)核酸的鉴定1. 浓度鉴定 核酸浓度的测定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。 紫外分光光度法:该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线,其最大吸收波长为260nm,这一物理特性。前提:核酸样品要较纯,无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 g/mlZhejiang Provincial Key Lab of Medic
11、al Genetics荧光光度法:核酸在荧光染料溴化乙锭(ethidium bromide,EB)嵌入碱基平面后,本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光,且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 纯度鉴定 紫外分光光度法或荧光光度法皆可用于核酸制品的纯度鉴定。紫外分光光度法:该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中,纯DNA的A260/A280为1.8,纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。荧光光度法:用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的
12、纯度。DNA分子较RNA大得多,电泳迁移率低。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics完整性鉴定琼脂糖凝胶电泳法:以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。基因组DNA片段如发生降解,电泳图呈拖尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中,三条带的荧光强度积分应呈特定的比值,如有改变则提示有RNA的降解。此外,若在点样孔附近有着色条带,则说明存在DNA 的污染。其它方法:必要时,还可通过一些特殊的实验来鉴定RNA的完整性。 如小规模的cDNA第一条链的合成反应,已知大小的某种mRNA的Northern杂交等Zhejiang Provincial
13、 Key Lab of Medical Genetics(1) 对DNA DNA样品溶于pH8.0的TE,4 或-20 保存;在-70可保存数年 长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2) 对RNA RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中,-70 保存; 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; 在RNA溶液中,加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70,可保存数年。(二)核酸的保存Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics尽管基因组DNA因来源、性质以及制备的目的不同,其分离纯化的方法不尽相同,但
14、有关分离纯化的原则、主要步骤、主要技术、主要试剂及其作用原理是一样的。基因组DNA分离纯化的一般程序见图7-4。真核基因组DNA的分离纯化Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics真核基因组DNA分离纯化的一般技术路线Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1、酚抽提法、酚抽提法(SDS法)法)本法最初于1976年由Stafford及其同事提出,通过改良,以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞,经蛋白酶K处理后,用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA,重复抽提至一定纯
15、度后,根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics裂解液中:EDTA:离子螯合剂,抑制DNase活性,降低细胞膜稳定性SDS:溶解细胞膜、核膜,乳化脂质、蛋白,并使其变性沉淀,同时变性DNase无DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化蛋白酶K:消化DNase和胞中的蛋白质酚:变性沉淀蛋白,抑制DNase活性pH 8.0的Tris溶液保证抽提时DNA进入水相,防止DNA变性Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geneticsq SDS
16、 SDS法流程图法流程图 (以动物组织为例)(以动物组织为例) 动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2 2、 甲酰胺解聚法甲酰胺解聚法该法操作步骤少,但耗时,所得DNA浓度低,适用于制备大片段DNA1987年Kupiec等报道了甲酰胺(formamide)解聚法,该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相似,但不进行酚的抽提,而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物(即染色质),然后通过火棉胶袋的充分透
17、析以除去蛋白酶K和有机溶剂。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 3 3、玻棒缠绕法、玻棒缠绕法用该法收集高分子量DNA的沉淀始于20世纪30年代,现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经改进而来。本法有两个关键步骤:一是基因组DNA沉淀在细胞裂解液和乙醇的交界面;二是将DNA沉淀缠绕在带钩玻棒上。带钩玻棒将大片段DNA从无水乙醇中转移至pH8.0的TE缓冲液中。该法以盐酸胍裂解细胞,制备的DNA片段约有80kb,适用于同时从不同细胞或组织标本中提取DNAZhejiang Provincial Key Lab of Med
18、ical Genetics物理方式物理方式:玻璃珠法、:玻璃珠法、超声波法、研磨法、超声波法、研磨法、冻融法冻融法化学方式化学方式:异硫氰酸胍法、碱裂解法:异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式生物方式:酶法:酶法q根据细胞裂解方式的不同有:根据细胞裂解方式的不同有:Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics吸附材料结合法:吸附材料结合法:q根据核酸分离纯化方式的不同有:根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸,低盐高值结合核酸,低盐高pHpH值洗脱值洗脱快捷高效。快捷高效。低盐
19、高低盐高pHpH值结合核酸,高盐低值结合核酸,高盐低pHpH值洗脱值洗脱适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物,从而达到分离目的。的物,从而达到分离目的。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics浓盐法浓盐法:有机溶剂抽提法有机溶剂抽提法:密度梯度离心法:密度梯度离心法:利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同,将二者分离在盐溶液中溶解度不同,将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内
20、容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics基因组基因组DNADNA片段的纯化片段的纯化纯化的原则与要求纯化的原则与要求纯化的方法有透析、层析、电泳及选择性沉淀等。无论采用何种方法从何种支持介质中纯化与回收所需要的DNA片段都要注意两个原则:一是提高片段的回收率;二要清除回收的DNA样品中的污染。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1.回收率 为提高DNA片段的回收率,可通过提高DNA样品的上样量和选择适宜的方法与
21、材料而实现。2. 纯度 常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法(column chromatography)。柱层析法采用的是阴离子交换层析的原理Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics从琼脂糖凝胶中回收DNA片段从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的方法主要有二乙基氨基乙基(diethyl aminoethyl,DEAE)-纤维素(cellulose)膜插片电泳法电泳洗脱法(透析袋及非透析袋电泳洗脱法)冷冻挤压法低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
22、从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。它是将含待回收DNA条带的凝胶块切出,用吸头或接种针将其压碎,然后以洗脱缓冲液浸泡,使DNA洗脱出来。该方法能很好地回收小于1 kb的ss或ds-DNA,依分子量不同,其回收率从小于30%至大于90%不等。回收的DNA纯度极高,无酶抑制剂,也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物,虽费时但操作简单,是小片段DNA回收的较好方法。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化Zhejiang Provincial Key L
23、ab of Medical Genetics质粒DNA的提取与纯化的经典方法包括: 碱裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等这些方法主要由质粒DNA的扩增、质粒DNA的释放、质粒DNA的分离纯化三个步骤组成Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1、碱裂解法、碱裂解法在NaOH提供的高pH(12.012.6)条件下,用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁,裂解细胞,与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性,释放出质粒DNA。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geneticsq碱裂解法原理碱裂
24、解法原理 染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多,且染色体分子大得多,且染色体DNADNA为为线状分线状分子,而质粒子,而质粒DNADNA为共价闭合环状分子;为共价闭合环状分子; 当用碱处理当用碱处理DNADNA溶液时,线状染色体溶液时,线状染色体DNADNA容易发生变性,共容易发生变性,共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH时即恢复其天然构象;时即恢复其天然构象; 变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒淀,而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液
25、相分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。中,从而可通过离心将两者分开。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics尽管碱溶液能破坏DNA中的碱基配对,但CCC质粒DNA因缠绕紧密而不易解链,只要不在碱性条件下变性太久,当pH调至中性时,CCC质粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋。该法操作简单、重复性好且成本低,制备的质粒纯度能满足DNA测序与PCR等实验要求,是使用最广泛的方法Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geneticsq碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液II
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