生物制药工艺技术基础课件.ppt

1、生物制药工艺技术基础章节提要第一节 生化制药工艺技术基础一、生物材料与生化活性物质二、生化活性物质的提取三、生化活性物质的浓缩与干燥四、生化活性物质的分离与纯化第二节微生物制药工艺技术基础(重点）一、微生物菌种的选育与菌种保藏二、微生物的培养三、发酵过程的控制第三节 生物技术制药工艺技术基础（自学）第四节 生物制药中试放大工艺设计一、生物制药中试放大工艺设计二、中试放大方法与内容第五节 生物药物的研究与新药申报一、生物药物的研究开发过程二、生物药物的新药申报1 生化制药工艺技术基础 天然生化药物：是以人体组织、动物、植物、微生物和海洋生物为原料，应用生物化学的原理、方法与生物分离工程技术加工制

2、造的一大类天然生物药物。 特点：来源广，疗效好，几乎无副作用。1.1 生物材料与生化活性物质1.1.1 生物材料来源动物脏器血液海洋生物植物微生物生物新资源 动物脏器来源脏器来源脏器来源生化药物生化药物胰脏胰脏激素、酶、多肽、核酸、多糖、脂类等激素、酶、多肽、核酸、多糖、脂类等脑脑脑磷脂脑磷脂、神经磷脂、胆固醇、神经磷脂、胆固醇、神经肽神经肽胃粘膜胃粘膜胃蛋白酶胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原蛋白酶、组织蛋白酶、胶原蛋白酶肝脏肝脏不饱和脂肪酸、磷脂类、维生素、酶类不饱和脂肪酸、磷脂类、维生素、酶类脾脏脾脏脾水解物、脾脾水解物、脾RNA、脾转移因子、脾转移因子小肠小肠酶类、肝素、激素类酶类、肝素、激素

3、类脑垂体脑垂体各种激素（促黑素、各种激素（促黑素、生长激素生长激素、催产素）、脑、催产素）、脑垂体后叶制剂垂体后叶制剂心脏心脏糖原、激素、酶类糖原、激素、酶类 胃粘膜：胃蛋白酶、凝乳酶等。 肝脏：肝RNA、造血因子、肝脏解毒素。血液、分泌物和其他代谢物来源来源来源生化药物生化药物血液血液人血制剂、抗凝血酶、免疫球蛋白、人血制剂、抗凝血酶、免疫球蛋白、-干扰素、白介素等。干扰素、白介素等。尿液尿液尿激酶、激肽释放酶、蛋白酶抑制尿激酶、激肽释放酶、蛋白酶抑制剂、表皮生长因子等剂、表皮生长因子等其他（胆汁、蛇毒等）其他（胆汁、蛇毒等）胆酸（胆汁），纤溶酶（蛇毒）胆酸（胆汁），纤溶酶（蛇毒）海洋生物来

4、源来源来源生化药物生化药物海藻海藻多糖类多糖类腔肠动物腔肠动物前列腺素、多肽、毒素等前列腺素、多肽、毒素等节肢动物节肢动物甲壳素甲壳素、毒素、毒素软体动物软体动物多糖、多肽、毒素多糖、多肽、毒素棘皮动物棘皮动物毒素、不饱和脂肪酸、胆固醇毒素、不饱和脂肪酸、胆固醇鱼类鱼类磷脂、磷脂、DHA、多肽、蛋白、激素、多肽、蛋白、激素爬行动物爬行动物酶、毒素酶、毒素海洋哺乳动物海洋哺乳动物维生素、激素、多肽维生素、激素、多肽 植物来源生物碱、强心苷、黄酮、皂苷、挥发油氨基酸、蛋白质、酶、激素、糖类、脂类、维生素等。如：木瓜木瓜蛋白酶 菠萝菠萝蛋白酶 人参人参多糖 黄芪黄芪多糖微生物来源细菌细菌氨基酸、有机

5、酸、糖类、维生素及酶等。氨基酸、有机酸、糖类、维生素及酶等。放线菌放线菌氨基酸、核苷酸、维生素、酶氨基酸、核苷酸、维生素、酶真菌真菌酶、有机酸、氨基酸、核酸、维生素、多糖酶、有机酸、氨基酸、核酸、维生素、多糖酵母菌酵母菌维生素、蛋白质多肽、核酸维生素、蛋白质多肽、核酸生物新资源动植物细胞大规模培养基因重组技术构建“工程菌”、“工程细胞”转基因动物、植物eg. 植物转基因疫苗找出编码抗原蛋白的基因转入载体质粒转入土壤杆菌转染植物细胞整合到细胞染色体中生成新植株eg. 动物乳腺生物反应器 上海交大医学遗传研究所研究构建了30多种乳腺特异表达载体，如大鼠、羊、奶牛等。1.1.2 生物材料的准备.一、

6、生物材料的选择有效成分含量高；原料新鲜、无污染；来源丰富；价格低廉；杂质少。二、生物材料的采集、预处理与保存材料采摘及时、完整，低温保存。保存方法：冷冻法、有机溶剂脱水法、防腐剂保鲜法。1.2 生化活性物质的提取（一）常用提取方法酸、碱、盐水溶液提取法表面活性剂提取法与反胶束提取法有机溶剂提取法双水相萃取法超临界萃取技术酸、碱、盐水溶液提取法v提取各种水溶性、盐溶性的生化物质。v应用举例：雄鸡冠中透明质酸的提取 相关实验项目：银耳多糖的提取、细胞色素C的提取丙酮脱水鸡冠提取液水相水（提取）氯化钠，氯仿（除蛋白）沉淀物乙醇（沉淀）透明质酸粗品（脱水、干燥）表面活性剂提取法常用：SDS，Tween

7、、Span系列等非离子表面活性剂。原理：增溶、乳化、分散有机溶剂提取v分为固-液提取和液-液萃取两大类。（1）固-液提取常用于水不溶性的脂类、脂蛋白、膜蛋白结合酶等。溶剂选择原则：“相似相溶”常用：甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、乙醚、三氯甲烷丙酮：脱水、脱脂（丙酮粉） 相关实验项目：蛋黄中卵磷脂的提取有机溶剂提取应用举例v应用举例：冻胰中胰岛素的提取粗制冻胰胰片酸醇提取液刨碎乙醇（87%左右、2.3-2.6倍；草酸（5%）pH2.5-3,13-16（2）液-液萃取v利用溶质在两个互不相溶的溶剂中溶解度的差异将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。v影响因素：pH、盐析、温度、乳化溶剂选择：K值、

8、易于回收、安全价廉。eg：青霉素的提取浓缩双水相萃取法双水相萃取法：利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。针对蛋白质易失活；部分蛋白质具较强亲水性，不溶于有机溶剂。类型：聚合物聚合物水系统：空间阻碍作用聚合物无机盐水系统：盐析作用超临界萃取技术v超临界流体萃取技术：利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有的特异增加物质溶解能力来进行分离纯化的技术。超临界流体性质 密度与液体相当萃取能力强 黏度接近气体传质性能好 扩散系数介于气体和液体之间。比液体大数百倍。超临界流体萃取的基本思想 利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下与待分离物料接触，萃取出目的产物，然后

9、通过降压或升温的方法，使萃取物得以分离CO2超临界流体物料萃取降压升温CO2流体萃取物1.2.2 影响提取效率的因素温度耐热生化成分：50-90；不耐热：0-10；一般20-25酸碱度：一般49，避免在等电点附近提取盐浓度：“盐析”，“盐溶”作用1.2.3 提取方法的选择v针对生物材料和目的物得性质选择合适溶剂系统与提取条件。v考虑因素：溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、含量、杂质种类及相关性质等。v选择依据：文献参考、试验探索eg.胸腺素的提取结构性质：80热稳定的40-50种多肽组成的混合物，分子量1000-15000，等电点3.5-9.5分离工艺：胸腺胸腺碎块提取液上清液丙酮粉

10、上清液盐析物超滤液(M15000胸腺素绞碎捣碎、提取生理盐水加热去杂蛋白80，15min沉淀丙酮-10pH7磷酸缓冲液、硫酸铵、饱和度0.25硫酸铵、饱和度0.5，pH4超滤PH8脱盐、干燥1.3 生化活性物质的浓缩与干燥1.3.1 浓缩方法： 盐析浓缩 有机溶剂沉淀浓缩 葡聚糖凝胶浓缩 聚乙二醇浓缩 超滤浓缩 真空减压浓缩与薄膜浓缩盐析浓缩 添加中性盐使某些蛋白质（或酶）从稀溶液中沉淀，从而达到浓缩目的。 常用盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、硫酸镁等有机溶剂沉淀浓缩加入有机溶剂使生化物质溶解度明显降低而沉淀析出的方法。优点：不必除盐、溶剂易回收缺点：可能造成蛋白质变性葡聚糖凝胶浓缩稀样品溶液（1

11、L)过滤凝胶，溶液中再加干凝胶加固体干葡聚糖凝聚G-25，搅拌30min以上操作反复数次，浓缩数倍(100ML)聚乙二醇浓缩聚乙二醇样品溶液透析袋超滤浓缩v应用不同型号超滤膜浓缩不同分子量的生物大分子。 真空减压浓缩与薄膜浓缩 优点：蒸发温度低、速度快1.3.2 干燥v使物质从固体或半固体状经除去存在的水分或他种溶剂，从而获得干燥物品的过程。v目的：提高药物或药剂稳定性，利于保存和运输使药物或制剂有一定规格标准便于进一步处理干燥方法 减压干燥 喷雾干燥 冷冻干燥减压干燥（真空干燥）密闭容器中抽去空气后进行干燥的方法。加速干燥、降低湿度、使干燥产品疏松和易于粉碎，提高产品质量箱式真空干燥机双锥真

12、空干燥机喷雾干燥v待干燥物质经浓缩成一定浓度的液体后经设备喷雾后形成极大表面，在短时间内干燥的技术。喷雾干燥流程冷冻干燥v低温低压条件下、利用水的升华性能而进行的一种干燥方法。1.4 生化活性物质的分离与纯化1.4.1 生化制药工艺中分离制备方法的特点生物材料组成复杂化合物含量低生物活性成分稳定性差溶液各参数对组分影响难以预估逐级分离方法操作时间长，工艺复杂1.4.2 分离纯化基本原理根据分子形状和大小不同进行分离：膜分离、超滤、凝胶过滤、差速离心根据分子电离性质的差异：离子交换法、电泳法根据分子极性大小及溶解度不同：溶剂提取法、盐析法、有机溶剂沉淀法根据物质吸附性质的不同：吸附层析根据配体特

13、异性：亲和层析1.4.3 分离纯化方法设计基本程序 确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法 制备物的理化性质和稳定性的预备实验 材料处理及抽提方法的选择 分离纯化方法的摸索 产物的均一性测定2 微生物制药工艺技术基础菌种获得途径：自然选育、人工诱变2.1 菌种的选育与保藏2.1.1 菌种的分离与筛选 菌种的分离：收集富集培养分离纯化 菌种的筛选：文献参考、经验参考2.1.2 菌种的选育v选育手段：自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程技术v选育目的：提高发酵产量改进菌种性能产生新的发酵产物去除多余的组分（1）自然选育自然选育：利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分

14、离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产水平菌株的过程。以达到稳定和提高生产能力的目的。优点：简单易行 缺点：效率低、进展慢自然突变频率仅10-6-10-10左右。自然选育的一般过程生产菌种斜面制备单孢子（或细胞）悬浮液涂布平板、培养后挑取单菌落斜面种子培养摇瓶发酵高产菌株初选菌种保藏斜面种子培养摇瓶种子培养摇瓶发酵高产菌株复选高产菌株验证初筛复筛（2）诱变育种 诱变育种：利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群体，促进其突变率大幅提高，然后采用简便、高效的筛选方法，从中选出少数具有优良性状的突变菌株。 优点：速度快、收效大、方法简单诱变的主要环节出发菌株的选择诱变处理突变株的

15、筛选 出发菌株的选择纯种 性状优良诱变敏感 适宜发育时期诱变处理（重点）诱变剂的选择：防止诱变效应饱和。诱变剂用量的选择：高致死剂量、中等剂量影响诱变效果的因素：菌种生理状态、被处理菌株的预培养和后培养条件、诱变处理时外界条件等。诱变剂类型诱变机理品种物理诱变剂物理辐射紫外线、X射线，激光、电磁波化学诱变剂与DNA发生作用、改变其结构、引起遗传变异碱基类似物、烷化剂、移码突变剂（亚硝酸、硫酸二乙酯、亚硝基胍等）生物诱变剂引起DNA结构改变噬菌体、人工构建的质粒出发菌株的培养孢子悬液或菌悬浮液的制备紫外线照射后培养稀释涂平板eg. 紫外线诱变过程eg. 亚硝基胍诱变处理方法：1.制备菌悬液2.配

16、制NTG母液3.NTG与菌体的作用4.NTG作用的终止5.稀释涂平皿13mg/ml、30120min、2632生理盐水洗涤菌体，离心后重新制备菌悬液 突变株的筛选筛选：将分离培养后的各型单菌落中性状优良、具有高发酵能力的突变菌株挑选出来过程。初筛：从大量菌株中发现有苗头的优良菌株，筛选量大，准确度要求不是很高。复 筛：注重准确性和可重复性。一支菌种要接种35个发酵摇瓶，采用二级发酵，力求试验结果准确可靠筛选方法a.随机筛选：随机挑选平板分离后的单菌落，从中筛选具有优良性状的菌株。b.理性化筛选摇瓶筛选琼脂块筛选摇瓶筛选法 操作步骤平板分离单菌落接种斜面培养摇瓶发酵测定生物活性物质含量高产菌株的

17、筛选初筛复筛琼脂块筛选法b 理性化筛选：根据产物已知或可能的生物合成途径、代谢调控机制和分子结构设计的一些筛选方法。打破微生物原有代谢调控机制，获得能大量形成发酵产物的高产突变株。 突变株中高丝氨酸脱氢酶失活，不能合成高丝氨酸，使其全部用于赖氨酸的生物合成，有利于赖氨酸的合成。天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰半醛高丝氨酸蛋氨酸苏氨酸丙酮酸异亮氨酸天冬氨酸激酶反馈抑制赖氨酸高丝氨酸脱氢酶（HD）争夺底物，解除反馈抑制高丝氨酸的营养缺陷型突变菌株（3）杂交育种 杂交育种：将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状菌株的过程。甲生长快、产量低乙生长慢、产量高生长快

18、、产量高杂交过程I.两亲本菌株细胞间接合II. 染色体部分转移III. 形成部分结合子IV.交换、重组V. 重组体的产生是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质从供体菌转移给受体菌。 （4）原生质体融合育种 原生质体融合技术（P68）：把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和Ca+作用下，发生原生质体的融合，促使两亲本的遗传物质进行交换，从而实现遗传重组。 在适宜条件下，进行融合细胞的再生，获得具有新的遗传性状的重组菌株。原生质体融合（5）基因工程技术v将某一生物体（供体）的遗传信息在体外经人工与载体相接（重组），构成重组DNA分子，然后转入另一微生物体（受体）细胞中，使外源DNA片段

19、在后者内部得以表达和遗传。eg. 人胰岛素生产的原理2.1.3 菌种的保藏目的： 不死亡 不生长、不污染使菌种： 不降低或不丧失其优良性状 以尽延长其使用时间意义：有利于基础研究和实际应用原理 根据微生物的生理特征，人为地创造不利于微生物的生长条件，使微生物处于代谢不活跃，生长繁殖受抑制地休眠状态，减少菌种地变异。菌种保藏的方法 斜面保藏法 液体石蜡保藏法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 冷冻干燥保藏法 液氮超低温保藏法 甘油保藏法 孢子滤纸保藏法斜面保藏法：菌种接种于适宜斜面培养基中或进行穿刺培养，菌体生长成熟后，放入4冰箱保存。间隔一定时间需重新移植培养。保藏时间：放线菌46、3个月，酵母菌46

20、个月优点：简单方便，成本低，能随时观察菌株是否死亡、变异、退化或染菌。缺点：变异、退化、染菌几率增大广泛用于细菌、放线菌、酵母菌等的短期保存。液体石蜡保藏法（矿油保藏法）用石蜡覆盖生长丰满的斜面菌种上。加塞并用石蜡封口，直立低温保存。石蜡灭菌、烘干倾注或移入生长成熟、丰满的斜面菌种上加塞并用固体石蜡封口、直立低温保存0.1Mpa,3060min16012h 特点：防止水分蒸发，隔绝氧气，降低微生物代谢，延长保存时间，效果更好。 缺点：占空间较大；容易造成生产力降低；不适合以石蜡为碳源的微生物。菌种保藏期间要定期做存活率和活性试验，一般2-3年一次。冷冻干燥保藏法将菌液在冻结状态下升华其中的水分

21、，获得干燥的菌体样品。优点：保藏期长，变异小、适用范围广。缺点：操作烦琐、技术要求高、需冷冻干燥设备冻干管液氮超低温保藏法 操作方法：n 配液：将浓的菌悬液加入灭菌的保护剂中，分装到安瓶中（0.2-1ml）n 封口n 冷冻：至-25左右放入液氮罐中。在-150- -196保藏。 解冻：快速解冻，将安瓶立即放在38-40温水中震荡1-2min，有利于细胞复苏。 优点：操作简便、高效，适合各种微生物。保藏时间长。 缺点：需购置超低温液氮设备，液氮消耗量多，操作费用较高。10甘油、5二甲基亚砜液氮保藏管液氮罐甘油保藏法 保藏方法：将拟保藏菌种的对数期培养液直接与经121蒸汽灭菌20min的甘油混合，

22、使甘油浓度在1015%，再分装于小试管中，低温冰箱保藏。 保藏时间：-20可保藏0.51年；-70可达10年。 特点：操作简便、保藏期长，需超低温冰箱。其他干燥保藏法 沙土管保藏法、麸皮保藏法等。课堂练习一 连连看二 填填看（1）不利于微生物生长繁殖的条件有（ ）（ ）（ ）（ ） 低温/缺氧/干燥/寡营养（2）冷冻干燥保藏法使用（ ）或（）作为保护剂。 甘油/二甲基亚砜三 说说看液氮保藏菌种在复苏时有什么特别要求。哪些菌种保藏方法适合专业机构进行菌种保藏，哪些又适合发酵企业进行菌种保藏，为什么？2.2 微生物的培养2.2.1 培养基：人工配制的、供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需的多

23、种营养物质的混合物。碳源碳源牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、烃类牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、烃类氮源氮源牛肉膏、蛋白胨、尿素、铵盐牛肉膏、蛋白胨、尿素、铵盐能源能源各种碳源各种碳源生长因子生长因子维生素、碱基等维生素、碱基等无机盐无机盐磷、硫、钾、钠盐磷、硫、钾、钠盐水水2.2.2 培养基的种类 按组成物质来源：合成培养基、复合培养基 按物理状态：固体培养基、液体培养基 按工业发酵中的用途：孢子培养基、种子培养基、发酵培养基、补料培养基。 按组成物质分类类型成分特点适用范围合成培养基物质的化学成分明确、稳定 重现性好； 营养成分单一，价格昂贵；研究菌种的营养需求、新陈代谢及其代谢过程中物质的变化等复合培养

24、基由化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物组成 来源丰富、价格低廉；营养丰富、成分复杂； 批次间原料质量有差异，稳定性差；大规模工业发酵课堂讨论 PDA培养基 配方：（g/L） 马铃薯粉 6.0 葡萄糖 20.0 琼脂 20.0 pH值 5.6 0.2 25 适用于酵母菌的培养 LB培养培养基。配方：（g/L） 胰蛋白胨 10.0酵母提取物 5.0氯化钠 10.0 蒸馏水 若干 适应于细菌的培养试判断这两种培养基的类型？ 按形态分类固体培养基：加入一定凝固剂（琼脂）的培养基。适用于：菌种培养、分离、菌种保藏。液体培养基：未加任何凝固剂的培养基。可通过振荡和搅拌，有利于营养物质的均匀分布和

25、氧的传递适用于：大规模工业生产和实验室研究。按工业用途分类孢孢子子培培养养基基 供供繁殖孢子繁殖孢子用用的培养基；的培养基；能使菌体生长能使菌体生长良好，产较多良好，产较多孢子；不易引孢子；不易引起菌种变异起菌种变异 营养成分营养成分不宜太丰富不宜太丰富，碳，碳源和氮源浓度低；无机盐源和氮源浓度低；无机盐浓度要适量；浓度要适量；pH和湿度和湿度适宜适宜麸皮、小米、大米培养基。麸皮、小米、大米培养基。种种子子培培养养基基 供供孢子发芽孢子发芽和和大量大量繁殖菌丝繁殖菌丝体体用的培养基；用的培养基；种子的扩大培种子的扩大培养，增加细胞养，增加细胞数量，使菌体数量，使菌体长成年轻、代长成年轻、代谢旺

26、盛、活性谢旺盛、活性高的种子。高的种子。营养丰富完全营养丰富完全；pH稳定；稳定；营养物质浓度略稀薄，使营养物质浓度略稀薄，使溶氧量较高；溶氧量较高；最后一级种子培养基的营最后一级种子培养基的营养成分要尽可能接近发酵养成分要尽可能接近发酵培养基培养基按工业用途分类发发酵酵培培养养基基供发酵产生代供发酵产生代谢产物用谢产物用有利菌体进一有利菌体进一步生长繁殖步生长繁殖有利于产生更有利于产生更多的代谢产物多的代谢产物 营养成分适当丰富和完全；营养成分适当丰富和完全； pH稳定；稳定； 添加特定元素、前体、诱导添加特定元素、前体、诱导物和促进剂等有利于产物合物和促进剂等有利于产物合成；成； 控制原料

27、质量，防止原料波控制原料质量，防止原料波动对生产造成影响动对生产造成影响。补补料料培培养养基基 发酵过程中间发酵过程中间隙供应营养物隙供应营养物质质有利于菌体生有利于菌体生长、代谢及发长、代谢及发酵参数的稳定酵参数的稳定 单一或复合成分营养物单一或复合成分营养物质质 发酵过程中适合时期补发酵过程中适合时期补料加入。料加入。 影响培养基质量的因素原材料质量水质灭菌培养基黏度 发酵用水：深井水、地表水、自来水、蒸馏水等。 水源质量考察参数：pH、溶氧、可溶性物质、污染程度、矿物质组成和含量。 高压蒸汽灭菌，121、2030min 灭菌不当造成影响： 破坏营养成分；营养物质发生反应，造成营养成分损失

28、；产生有害物质。影响氧传递和微生物的氧利用度，对分离提取造成不便。2.2.3 灭菌和除菌一、灭菌方法高温灭菌5类型灭菌介质灭菌条件适用范围干热灭菌干热空气160、12h耐热器械、容器湿热灭菌高压饱和蒸汽121 、105 pa、2030min培养基、发酵罐、设备管道等热空气灭菌柜纯蒸汽灭菌柜蒸汽灭菌锅过滤除菌：微孔滤膜（0.2um/0.4um）或纤维介质等。 澄清流体的除菌（氨水、丙醇、空气等）化学物质消毒和灭菌：甲醛、乙醇、苯酚、季胺盐等； 厂房等空间、皮肤消毒。其他灭菌方法辐射灭菌210230nm紫外线、0.0060.14nmX射线等。臭氧灭菌静电除菌二、培养基的灭菌方法（掌握）（1）实罐灭

29、菌（实消）将配制好的培养基输入发酵罐内，经过间接蒸汽预热，然后直接通入饱和蒸汽加热，使培养基和设备一起灭菌，达到要求的温度和压力后维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度。温度：121时间：30-60min（2）空罐灭菌（空消）发酵罐体的灭菌。罐压：1.5-2个大气压温度：125-130时间：30-45min （3）连续灭菌（连消）：培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的灭菌工艺。优点：高温、快速灭菌，营养成分破坏少；发酵罐非生产占用时间短，容积利用率高；热能利用合理；蒸汽用量平稳但压力高。缺点：不适用黏度大或固型物含量高的培养基灭菌；需连续灭菌设备，投资较大，

30、增加中间环节。2.2.4 微生物的培养方法微生物培养：将微生物接种于培养基中，在特定条件下增殖的过程。培养装置：恒温箱、震荡培养器、发酵罐等培养方法固体培养法：斜面培养、平板培养、穿刺培养、其他（米曲、面包等）固体培养法。液体培养法：静止培养法、震荡培养法2.3 发酵过程的控制（一）发酵参数控制目的：取得理想发酵效果、得到高产优质发酵产物。先决条件：了解发酵过程进行的状况控制手段：发酵罐内取样分析获得有关信息，进而根据发酵状况作出调整。通过取样分析获得的有关发酵的信息也称为参数，可分为物理、化学和生物三类。（一）物理参数（1）温度：影响酶活、溶氧量和发酵液的物理性质（2）压力：防止外界杂菌侵入

31、；增加氧气饱和溶解度。通常控制在0.020.05MPa。（3）搅拌转速：指搅拌器在发酵过程中的转动速度。转速高低影响发酵液中液相体积氧传递系数、发酵液的均匀性和发酵液中泡沫的程度。（一）物理参数（4）搅拌功率：搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每立方米发酵液所消耗的功率。一般24（KW/m3）（5）表观黏度：与发酵液中菌体浓度、菌体的形态和培养基成分有关。单位：PaS（一）物理参数（6）空气流量：单位时间内向发酵罐中通入空气的量。 影响液相体积氧传递系数KLa、代谢废气的排出，发酵液中泡沫的生成。 通气量的表示方法：绝对流量（P136）：单位时间内通入发酵罐中无菌空气的体积（L/min）相对流量：

32、每分钟、单位体积发酵液中通入无菌空气的体积，大多数需氧菌发酵通气量0.81.5V/（Vmin）（二）化学参数：（1）pH值（2）基质浓度 糖浓度 氮浓度 磷酸盐含量 产物浓度 溶解氧浓度 废气中氧含量 废气中二氧化碳含量（1）pH值发酵过程中各种产酸和产碱的生化反应的综合结果。与菌体生长和产物合成有着重要关系，pH的变化反应菌体代谢状况，长时间pH过低，还可能是发酵染菌的结果。（2）基质浓度： 发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。对生产菌的生长代谢有重要影响。1、糖浓度的测定：总糖水解法；还原糖斐林试剂法2、氮浓度的测定： 总氮：发酵液中含有氮元素总量和，包括了发酵液中所有以各种形式存在的

33、氮元素的总量。测量时以强酸水解，将含氮化合物中氮元素释放出来，以凯式定氮法测定。 氨基氮：以氨基酸形式存在的氮元素，采用甲醛法测定。3、磷酸盐含量测定：钼酸铵比色法4、产物浓度测定：判断代谢是否正常，决定放罐依据。氨基酸（g/l）、抗生素（效价单位）5、溶解氧浓度的测定：了解产生菌对氧利用的规律，发现发酵异常情况，也可作为发酵中间控制的参数及设备供氧能力的指标。用绝对氧含量（mmol/L或mg/L）表示。6、废气中氧含量：算出产生菌的摄氧率。7、废气中CO2含量：算出产生菌的呼吸熵，了解产生菌的代谢规律。 （三）生物参数菌体浓度菌丝形态菌体浓度控制微生物发酵过程的重要参数，特别是对抗生素等次级

34、代谢产物的发酵控制。意义：菌体量的大小和变化速度对合成产物的生化反应有重要影响；菌体浓度与培养液表观黏度有关，间接影响发酵液溶氧量；为补料和供氧提供依据。菌丝形态菌丝形态的变化可反映菌体的生长阶段和菌体内代谢变化。菌丝的形状：了解菌体所处生理阶段和代谢状况菌丝的粗细：反应菌体生长代谢是否旺盛染色的深浅：反应菌体代谢状况。脂肪颗粒：菌体胞内营养贮存物，与菌体生理阶段有关。空泡：反映胞内DNA含量的变化。（二）发酵过程的变化规律与控制按发酵过程中投料方式的不同，可将发酵分为分批发酵补料分批发酵连续发酵分批发酵 指一次性投入料液，发酵过程中不补料，一直到放罐的发酵过程。特点 微生物所处的环境在不断地

35、变化， 其物理、化学和生物学参数都随时间而变化， 是不稳定的过程补料分批发酵 是在发酵过程中一次或者多次补入含有一种或多种营养成分的新鲜料液，以达到延长发酵周期，提高产量的目的。优点： 可延长发酵周期，提高产量 可避免高浓度营养物对代谢产物生物合成的抑制作用 缺点：发酵工艺复杂 连续发酵v是在特定的发酵设备中进行的，一边连续不断的输入新鲜无菌料液同时连续不断的放出发酵液。罐式连续发酵管式连续发酵（三）发酵过程的重要影响参数与控制1、温度的影响与控制Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q显Q辐射温度对发酵的影响影响酶的活性影响发酵液的物理性质：影响代谢产物合成的方向发酵温度的控制： 可通过冷却设备进行降温。

36、2、 pH的影响及其控制适宜大多数微生物生长的pH3-6，变化范围0.5-1pH上限：8.5 pH下限：2.5pH对发酵的影响：影响酶活影响基质或中间产物的解离状态：物质透膜速度不同，代谢速度不同。影响发酵产物的稳定性发酵pH的控制 调整发酵培养基的组成： 通过补料控制： 在发酵培养基中加入pH缓冲剂； 改变发酵条件： 直接加酸、碱调节3、溶解氧的控制 大多数发酵类型：需氧发酵 C6H12O6+6O2 6H2O+6CO2能量 溶氧控制关键：供氧=需氧4、二氧化碳的影响与控制vCO2的影响：降低发酵液pH、抑制微生物生长和发酵、与其他物质生成沉淀等v影响CO2的因素：菌体呼吸强度、发酵液性质、通

37、气搅拌、设备等。v控制方式：加强通气搅拌、加碱中和、罐压调节 5、泡沫的影响及其控制泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系，气液之间被一层液膜隔开，彼此不相联通。 类型： 机械性泡沫：存在于发酵液表面上面的泡沫。气相比例大，与液体有明显界限。 流态泡沫：存在于发酵液中的泡沫，分散在发酵液中，较稳定，与液体之间无明显界限。泡沫对发酵的影响影响发酵罐的装料系数，降低发酵产量泡沫过多容易造成逃液，发酵液溢出，增加染菌机会。影响气体的交换和氧的传递部分发酵液粘附于罐壁失去作用，影响放罐体积和产量泡沫严重时，被迫停止搅拌或通气，容易造成菌体缺氧，导致代谢异常。泡沫的控制 机械消沫：利用强烈机械震动或压力

38、变化而使泡沫破裂。如安装消沫桨。 消沫剂消沫： 常用消沫剂（熟悉）：天然油脂（豆油、玉米油等）、高碳醇或酯类（PEG等）、聚醚类及硅酮类案例：青霉素的发酵生产冷冻管母斜大米孢子一级种子罐二级种子罐发酵罐放罐提炼孢子培养25，6-7d种子培养25，40-45h1:2L/(Lmin）种子培养25，13-15h1:5L/(Lmin）孢子培养25，6-7d发酵22-26，6-7d1:（1-0.8）L/(Lmin）冷却至15菌种：丝状黄青霉菌种子制备：孢子培养：母斜、米孢子培养基：碳源（淀粉酶解的葡萄糖化液流加）；氮源（玉米浆、花生饼粉）前体（苯乙酸或苯乙酰胺）发酵控制：pH:6.4-6.6温度：前期2

39、5-26，后期23通气：1：0.8L/(Lmin)消沫：天然油脂（已淘汰）、化学消沫剂（泡敌）4 生物制药中试放大工艺设计中试放大是由小试转入工业化生产的过渡性研究工作，对小试工艺能否进入规模化生产至关重要。一、生物制药中试放大工艺特点4.1 中试放大实验目的提供工艺条件和参数提供足量合格产品拟定符合GMP要求的制造规程与检定规程4.2 进入中试应具备的条件收率稳定、质量可靠操作条件已经确定，产品、中间体及原料的分析方法已经制定生物材料的资源已确定并已系统鉴定进行过物料平衡，“三废”问题已有初步处理方法提出中试规模及所需原辅料的规格和数量提出安全生产要求工艺条件关键问题1、原辅料规格的过渡实验

40、2、设备选型与材料质量实验3、反应条件限度实验4、原辅材料，中间体及产品质量分析方法研究5、下游工艺研究二、中试放大方法与内容（一）中试放大方法：经验放大法、相似放大法、数学模型放大法。经验放大法：凭借经验通过逐级放大（实验装置、中间装置、中型装置和大型装置）来摸索反应器的特征。中试放大内容：工艺路线与各步反应方法的最后确定设备材质与型号的选择反应器的规模选择及反应搅拌器形式与搅拌速度的考查生产反应条件的研究工艺流程与操作方法的确定物料衡算安全生产与“三废”防治措施研究原辅材料、中间体的物理性质和化工常数的测定原辅材料、中间体质量标准的制定消耗定额、原料成本、操作工时与生产周期等的计算5 生物

41、药物的研究与新药申报生物药物研究开发过程：（一）制定研究计划和制备新化合物阶段调查研究，收集资料，整理文献，制定计划进行实验和制备供筛选化合物。（二）筛选和临床前研究阶段（三）临床试验研究阶段（二）筛选和临床前研究阶段筛选：动物模型、体内实验临床前研究：实验研究阶段：生产用菌、毒种和细胞株的构建、培养和生物材料的选择，提取、纯化、理化特性研究小量试验阶段：制定给药方案、建立制备工艺及检定方法，小批量样品的临床前安全、有效性实验。中间试制阶段：生产工艺定型、产品质量标准制定、全面临床前研究（药理、毒理、“三致”性）、提供临床试验研究用量的连续三批产品。（三）临床试验研究阶段新药临床试验是指对其临

42、床疗效和安全性做出评价，通过各期临床试验，对新药作出能否上市的结论。药物临床试验质量管理规范临床试验分四期。批准上市前，应当进行一、二、三期临床试验1、一期临床：初步的临床药理学及人体安全性评价试验2、二期临床：治疗作用初步评价阶段3、三期临床：质量作用确证阶段4、四期临床：新药上市后由申请人进行的应用研究阶段。考察在广泛使用条件下药物的疗效、不良反应等。生物药物的新药申报新药申请：是指未曾在中国境内上市销售的药品的注册申请。药品注册申请人向所在地省、自治区、直辖市（食品）药品监督管理部门提出申请。新药注册申请应报送的资料：1、综述资料2、药学研究资料3、药理毒理研究资料4、临床试验资料5、其

43、他课堂练习1、生化制药的生物材料来源有：动物脏器、血液及代谢物、海洋生物、植物、微生物2、生化药物干燥的方法有：减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥3、常用的菌种选育方法有：自然选育、诱变育种、原生质体融合育种、杂交育种4、发酵罐可采用的灭菌方法有：实罐灭菌、空罐灭菌5、培养基可采用的灭菌方法有：实罐灭菌、连续灭菌6、按照用途分类，培养基可分为：孢子培养基、种子培养基、发酵培养基、补料培养基7、微生物的培养方式分为：固体培养法和液体培养法本章小结第一节 生化制药工艺技术基础生物材料和生化活性物质生化活性物质的提取生化活性物质的浓缩与干燥生化活性物质的分离与纯化第二节 微生物制药工艺技术基础微生物菌种的选育与菌种保藏微生物的培养发酵过程的控制第四节 生物制药中试放大工艺设计第五节 生物药物的研究和新药申报