第十二章-食品中转基因成分的检测课件.ppt
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1、1第一节 概述 转基因生物:利用基因工程技术改变基因组的构成, 用于农业生产或者农产品加工动植物、微生物及产品。主要是转基因植物。 转基因食品:转基因动植物、微生物产品,如转基因大豆:转基因动植物、微生物产品直接加工品,如转基因大豆油:以 和为原料生产的食品和添加剂,如转基因大豆油加工成的人造奶油。 转基因成分(外源基因成分):物种本身不具有的,而是来源于其他物种的功能基因序列。2转基因食品的特征 具有其原有基因表达的性状和功能 存在外源DNA的表达产物及其生物活性3基因重组体 载体:自我复制,运载工具 目的基因:转基因生物性状改变直接相关DNA 调控元件:使目的基因表达精确开始和终止,表达增
2、强 标记基因:进行标记以便筛选转化细胞 报告基因:编码某种易于检测蛋白质或酶的基因基因组基因组基因组基因组启动子启动子终止子终止子外源目的基因外源目的基因基因重组体示意图基因重组体示意图4外源基因表达的产物主要包括:目的基因、标记基因和报告基因表达的蛋白,或意外表达的蛋白。使得其具有有传统食物有不同的生物特性,由此产生安全性问题。5第二节 食品中转基因成分检验检测方法概述主要针对外源DNA 及其表达产物DNA分析蛋白质抗原特性PCR法ELISA和蛋白印迹法6检测流程采样采样混样混样样品制备样品制备目标物质提取目标物质提取PCR或蛋白质检测或蛋白质检测结果判断结果判断结果报告结果报告7采样要求1
3、 一般规定:所用器具清洁干燥无DNA和蛋白质污染;避免样品散落,防止污染生态环境;短时间内完成,避免样品组成发生变化2 抽样方法:随机原则;“三层五点”;若加工工程损坏DNA,则加大采样量8采样要求3 抽样数量:根据转基因限量水平确定每批中应抽取的原始样品最小数量4 样品制备与保存:分三份,用于检测,复检和备查;及时加贴标签,注明编号、货物名称、品种、抽样时间、抽样人及其他必要信息9外源基因检测 根据检测目的和检测结果特异性水平不同, 检测方法可分为四类:初筛试验:普遍存在的基因重组通用元件基因特异性试验:基因重组体中含有的外源基因组成结构特异性试验:目的基因与调控基因连接处的核苷酸序列事件特
4、异性试验:插入的基因序列和植物基因组之间的连接区10DNA提取及纯化 为什么要提取纯化?植物细胞中DNA主要存在于细胞核和细胞质中,细胞中各种DNA称为总DNA,其中95%以上的DNA是与蛋白质结合存在的。植物细胞中还存在大量多糖、蛋白质、多糖、多酚类物质和RNA等成分。 这些物质都会影响后续DNA的PCR检测。11DNA提取及纯化转基因成分检测时需要先提取总DNA,利用去污剂或有机溶剂破坏细胞膜,裂解细胞,是DNA与蛋白质分离并游离于提取液中,然后去除杂质成分。DNA纯化的原理是根据乙醇或异丙醇竞争结合水分子的能力远强于DNA,在DNA提取液中加入乙醇或异丙醇,DNA因溶解度降低而析出。 1
5、2DNA提取方法 一类:改进的传统方法,如苯酚-氯仿法、溴化十六烷基三甲基胺法(简称CTAB法)、二氧化硅法等。第二类:试剂盒法,试剂盒法因为操作简便而被广泛应用。 13CTAB法样本准备:样本准备:固体样本要研磨成大小在2mm以下的颗粒,也可以用液氮研磨至DNA充分释放并满足DNA提取的要求;液态样本可以通过离心沉淀、加热蒸发、冷冻干燥等方法得到干物质用于DNA提取。 14CTAB法原理CTAB能溶解细胞膜并能与DNA结合成CTAB-DNA复合物,该复合物可溶解于高盐溶液中(如氯化钠),蛋白质、多糖等物质在此溶解中因溶解度降低而生成沉淀,经离心后与复合物分离;然后将该复合物置于低盐溶液中,因
6、其不溶性而沉淀析出;最后将复合物沉淀溶解于高盐溶液中,加入乙醇使DNA沉淀,离心后获得纯化的DNA。 15CTAB法主要试剂 按下表配置试剂,定容至200ml,高压灭菌16DNA质量和纯度检测琼脂糖凝胶电泳 在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶里进行电泳,紫外灯下观察DNA条带判断核酸定量检测 紫外分光光度计测定基因组DNA溶液的OD值,OD260/OD280一般在1.7 1.9,高了表明有RNA污染,低了表明有蛋白质或有机溶剂污染。 17核酸PCR检测PCR即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加
7、。 PCR反应体系是由DNA模版、引物、dNTP 、DNA聚合酶、镁离子和缓冲液等组成。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 18变性:变性:94退火:退火:56延伸:延伸:7219我国标准检测方法核酸PCR定性检测:检测目标基因是否存在 (有没有)核酸PCR定量检测:检测目标基因存在的量(有多少)201 核酸核酸PCR定性检测定性检测检测原理是定性PCR检测对象包括转基因食品目的基因、启动子、终止子、标记基因等外源基因和元件。根据转基因产品的特异性序列设计引物,对试样中外源目的基因进行PCR扩增。依据扩增产物中是否存在预期特异性片段
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